テクノケミカル株式会社

TECHNO CHEMICAL corp.
生化学・免疫学等の研究用試薬及び関連機器輸入販売

バングス

マイクロスフェア セレクションガイド(微粒子/マイクロビーズ/ミクロスフェア)

Bangs Laboratories社は、(以下バングス社と略)は、1988年4月1日に設立され、1500品目以上の高品質で様々なマイクロスフェアを 全世界に製造販売している米国の会社です。テクノケミカル株式会社は、Bangs社の正規輸入元です。

Bangs社(バングス社)は、単分散ポリマー マイクロスフェア、蛍光マイクロスフェア、着色マイクロスフェア、高品質単分散シリカ マイクロスフェア、高品質磁性マイクロスフェア及び磁気セパレーター、NISTトレーサブル粒子径標準粒子、フローサイトメーター用標準粒子及び関連製品を、全世界の診断薬メーカー、大学及び研究機関、計測機器メーカー等に多数製造販売している実績があります。

マイクロスフェアは、診断薬、バイオ分離、機器校正及び工程管理用スタンダード等を含むアプリケーションで広く一般的に使用されています。進化し多様化する研究開発や臨床試験のニーズに答える為に様々な特徴のある粒子が利用されます。例えば、幅広い種類の粒子径で異なる粒子表面特性を持ったポリマー、シリカ、磁性マイクロスフェア,最新磁性マイクロスフェア等です。これらのビーズは、非常に大きな結合表面積を提供し、ターゲットの効果的な捕獲と分離を可能にします。更に、自動化と小型化に広く受け入れられ、従来の使用に非常に重要で、プロテオミクス、バイオフォトニクス及びバイオセンシング技術等の最先端の開発領域の成長にとって不可欠なものとなります。

マイクロスフェアは、アッセイやバイオ分離用の開発試薬や機器校正用標準粒子への使用に非常に便利で柔軟なシステムを提供します。様々な種類の微粒子が多数あり、基本的な粒子の選択を行う際には、アプリケーションに対する要求を考慮することが重要です。
取扱や検出の両面から物理的及び光学的特性や、更に、粒子径、粒度分布、粒子の物性、界面化学等のその他の要求される特性を考慮する必要があります。



【表1 粒子の特性一覧】
項目 検討事項
粒子径 平均粒子径
均一性(単分散)
粒度分布
物 性 密度
屈折率
親水性/疎水性
非特異的結合性
自家蛍光
界面化学 反応基
官能基の量
特殊な性質 可視色/蛍光色
超常磁性
粒子径

マイクロスフェアの粒子径は、アッセイに最適な効率化には非常に重要で、 更に他の因子に起因する場合があります。従来の診断法を検討する際に、 試験やアッセイ用形式は、一般に粒子径を要求します。例えば、ラテラルフロー検査では、 充分な分配を確実にするために約0.1〜0.4μmの非常に小さな粒子が使用され、 ビーズベースでのフローサイトメトリーでは約4〜10μmの細胞サイズの大きな粒子が 使用されます。磁性分離では、特にターゲットの捕獲と溶離を伴い、 磁性粒子が一般的な大きさで要求された分離特性が達成できれば、 磁性粒子の正確な粒子径の情報は重要ではない場合があります。 (Tec Notes 102参照)

粒子径は、表面積を決定します。例えば、粒径の小さい粒子の場合は、 粒子懸濁液の単位重量当たりの粒子の総表面積はより大きくなり、粒径の大きい粒子の 場合には、粒子1個当たりの表面積が大きくなります。粒子径は、粒子の扱い易さ、 遠心分離・透析・ろ過等の分離方法等の処理上の問題、更にコーティングに必要な リガンドの量に影響します。

マイクロスフェアの物性

微粒子の中で一般的な材質は、ポリスチレン(PS)シリカです。これらの粒子は、物理的及び光学的に異なった特性を持ち、アプリケーション によっては限界を示す場合があります。

ポリマー マイクロスフェアは、一般に疎水性で高いタンパク質結合能力を持ちます。 しかし、粒子の分散安定性を良くする為に、保管用バッファーに少量の界面活性剤 (例:0.01〜0.1% Tween 20又はSDS)を添加する場合があります。また、粒子合成の際には、 粒子表面に官能基を導入しビーズを開発する為に、機能性モノマーを ポリスチレンやメチルメタクリレートと共重合させる場合があります。 粒子に導入された官能基は、リガンドとの共有結合に利用され、また、 粒子懸濁液の分散安定性を向上させます。

シリカは、本質的に親水性でマイナスに帯電しています。従って、シリカの水系懸濁液は、 界面活性剤やその他の安定剤の添加は通常は必要ありません。 カルボキシル基やアミノ基修飾シリカ粒子は、一般的な共有結合プロトコルで利用され、 通常の非修飾シリカは、粒子表面に官能基を追加又は表面特性を調整する為に様々なシラン を使用して粒子表面の改質が行えます。

コーティング

通常のマイクロスフェアの基本的なコーティング方法には、下記3種類があります。

物理吸着
共有結合によるカップリング
アフィニティー結合

これらの方法は、微粒子の取扱いの項で詳しく説明致します。

粒子の特殊な性質

ライフサイエンス分野での多くのアプリケーションでは、更なる粒子特性が要求されます。 例えば、蛍光、可視色、磁性分離用に酸化鉄の粒子への含浸です。 ポリマー マイクロスフェアやポリマーベースの 磁性マイクロスフェア、 最新磁性マイクロスフェアは、特殊な有機溶媒膨潤法により内部的に着色され、 多くの標準粒子が作成できます。着色剤の濃度をコントロールすることで、 多重フローサイトメトリー・アッセイ用のQuantumPlex™やDragon Green Intensity Standard等の 特殊なニーズに合った異なる発光強度を持ったビーズが製造でき、 画像アプリケーションや連携した機器のQC管理をサポートします。 特殊なフローサイトメトリー標準用に粒子表面や粒子の内部的に 標識された様々な蛍光マイクロスフェアが利用できます。

異なるマトリックス・マグネタイト含有量・粒子表面の官能基等の様々な種類の 超常磁性マイクロスフェア>をご提供できます。新しいアッセイやアプリケーション開発の 為に、磁性粒子はアプリケーションの要求を念頭に評価される必要があります。

【表2 粒子の材質の違いによる物性値の違い】
下記の値は文献から引用した参考値です。実際の粒子の値は、ご購入された製品でご確認下さい。
項目 屈折率(589nm) 密度(g/cm3) ガラス転移点(℃)
ポリスチレン 1.59 1.05 95
シリカ 1.43〜1.46 2.0 >1000

マイクロスフェア アプリケーション

比濁法(Turbidimetric Assays)

臨床的な検体の分析は、重大な疾病(例えば心血管疾患、血栓症、細菌性感染症と進行中の 炎症性疾患)を治療する為に重要です。比濁分析は、患者の状態を迅速で定量的に評価可能 で、更に性能を向上した粒子の開発により、従来よりも10〜100倍の感度増加が知られてい ます。

Bangs社(バングス社)は、比濁分析開発用に幅広く使用可能な0.05〜0.5μmの サブミクロン領域の 修飾ポリスチレン マイクロスフェア非修飾ポリスチレン マイクロスフェア を提供致します。粒子表面を変えることで共有結合と物理吸着の両方をサポートし、 凝集反応で重要な非常に適合性の高いコーティングを可能にします。更に、 同社の高い合成技術により、OEM供給でのバルクの要求に対し、再現性の高い製品を異なる ロット間で製造可能です。Tech Notes 304(光散乱アッセイ)参照

ケミルミネッセンス アッセイ(Cemiluminescence Assays)

ケミルミネッセンス (ケミカル ルミネッセンス、化学発光法) アッセイは、 外部の光源では無く化学反応による発光に依存します。

Bangs社(バングス社)が開発した高品質磁性マイクロスフェアProMag™ HP (High Performance)は、 アッセイ開発用に細心の注意を払って設計されました。
ProMag™ HPは、過酸化水素を用いたケミルミネッセンス アッセイの際に、 バックグラウンドのオートシグナルが極めて低いという大きな特徴があります。 また、金属カチオンはケミルミネッセンス アッセイの際に妨害物質となることが 知られていますが、ProMag™ HPは、鉄に対する比色分析が行われた結果、 非常に低い値を示し、粒子からの金属カチオンの溶出が非常に少ないということが言えます。 (詳細は、Product Data Sheet 743参照)
ProMag™ HP は、 最適化された組成による優れたハンドリング性能と迅速な分離性能を両立します。

サスペンションアレイ(Suspension Arrays)

フローサイトメーター用サスペンションアレイは、1つのサンプルの中で複数のターゲットの 照合の為に異なるリガンドを結合したマイクロスフェアの分布数を特徴とします。 Bangs社のQuantumPlex™キットは、標準的なフローサイトメーター(励起488nm又は633nm)の マルチプレックス分析法開発用の一般的なプラットホームを提供します。 5種類のマイクロスフェア分布キットは、Starfire Red™の異なる強度でコード化され、 2つの粒径キット(4.4um及び5.5um)は、配列を広げるために結合されます。 QuantumPlex™ Mキットは、高均一な粒径6umの 磁性マイクロスフェアが特徴です。

ビーズELISA

ビーズElISAは、ミクロン/サブミクロン領域のポリマー マイクロスフェア磁性マイクロスフェア等の様々な粒子を使用して開発されました。 従来のマイクロプレートELISAより増大した表面積を提供し、自動化に最適化された 磁性粒子は、試薬処理と分析性能に関して更なる利点を提供できます。 Tech Notes 301参照

ラテックス凝集試験(LATs)

従来のラテックス凝集試験では、マイクロスフェアは血清や血液サンプル中の抗体の検出に 抗原をコーティングしていました。しかし、この方法では、抗体は抗原でコーティング されたマイクロスフェアを架橋し、粒子は凝集してしまいます。現在のラテックス凝集試験では、 陽性反応は、均一で粒状又は砂状の外観を持った乳白な懸濁液として視覚的に現れます。 未着色の白い粒子は黒いカード上に白い点を付け、着色粒子はスライド又は白いカードに 適用されます。Tech Notes 301参照

ラテラルフロー検査

サブミクロン領域の着色マイクロスフェアは、一般にラテラルフロー検査の移動相に使用されます。 鮮やかな色の粒子は、検査結果の目視による検出を可能にし、ヨーロピウム・キレート粒子の ような蛍光マイクロスフェアの場合は、専用のリーダーが使用されます。 Tech Notes 303参照

検査方法と粒子の関係 まとめ
【表2 粒子の材質の違いによる物性値の違い】
下記の値は文献から引用した参考値です。実際の粒子の値は、ご購入された製品でご確認下さい。
試験/検査フォーマット 粒子径 粒子の種類 リガンドとの結合方法 検出方法 テクニカルノート
比濁法(自動LAT) 50nm〜500nm 未着色マイクロスフェア 共有結合 濁度法 TN304
磁性ケミルミネッセンス法 1〜5μm ProMag™ HP 共有結合 >ケミルミネッセンス  
フローサイトメトリー (サスペンションアレイ) 2〜15μm/u> QuantumPlex™ QuantumPlex™M(マルチプレックス用コード化された分布)又は マルチプレックス) 共有結合又はストレプトアビジン/ビオチン経由 フローサイトメーター  
ビーズELISA法 1〜5μm ProMag™,ProMag™ HP 共有結合 分光光度計 TN303
ラテラルフロー検査 0.1〜0.4μm 移動相用 着色マイクロスフェア
(可視色)移動相用
共有結合又は物理吸着 分光光度計 TN303
約2〜3μm 捕獲部位用 未着色マイクロスフェア TN303
ディップスティック試験法 0.1〜0.4μm 着色マイクロスフェア
(可視色)
共有結合又は物理吸着 目視判定 TN303
ラテックス凝集法(LAT) 0.2〜1.0μm 未着色又は
着色マイクロスフェア
(可視色)
共有結合又は物理吸着 目視判定 TN301
高品質磁性マイクロスフェアによるアッセイ

磁性粒子は、試薬製造と分析性能の両面で多くの利点を与えます。 磁性粒子は、自動化し易く、簡単で非常に効果的な分離を提供します。 磁性粒子は、従来のイムノアッセイ法、分子アッセイ、遺伝子配列やプロテオミクスの アプリケーションで広範囲に利用されます。Tech Notes 102参照

【磁性粒子のアプリケーション】
以下の表は、一般的な磁性粒子のアプリケーションをご提案致します。 下記の表は、一般的なガイダンスとして提供されたもので、 更に文献調査やスクリーニング実験が必要な場合があります。
磁性分離用途 対応する製品
抗体精製/分離 BioMag® Protein A ,  BioMag® Protein G,   ProMag™ Protein G
タンパク質分離 BioMag®,   ProMag™,   ProMag™ HPCOMPEL
グルカン・糖タンパク質分離 BioMag® WGA,  BioMag® ConA
細胞分離 BioMag®抗CDマーカー,  BioMag® 2次抗体結合
細胞内小器官分離 BioMag®抗体結合
免疫沈降 BioMag® 2次抗体結合
mRNA分離 BioMag® Oligo dT(20)BioMag® mRNA精製システム
核酸分離 ProMag™ HC
ビオチン化オリゴヌクレオチド捕獲又は結合 ProMag™,ProMag™ HP,ProMag™ HC,COMPEL™, BioMag® Streptavidin
バイオパニング ProMag™,   COMPEL™,   BioMag®

マイクロスフェア 取扱方法

マイクロスフェアの表面に、抗体、オリゴヌクレオチド、ペプチド等のリガンドを、 診断や分離用にコーティングできます。マイクロスフェアのコーティング技術は、 非固有的な相互作用を最小化することで期待される粒子表面の特定な活性を達成する為に 最適化されます。更に、要求される安定性、開発時間の枠及び予算、コーティングされる 固有の生体分子も考慮されなければなりません。これらのファクターは、短期及び長期目的用に 最適なコーティング方法の決定に役立ちます。

物理吸着

物理吸着は、主に生体分子とポリマー マイクロスフェア 間の疎水的相互作用に依存します。このコーティング技術はいたって簡単で、精製されたリガンドとマイクロスフェアとのインキュベーションにより行われます。 通常は、最小限の最適化で済み、必要な試薬も比較的早く開発できる場合が多いです。 しかし、物理吸着は、分子と粒子間の複数の吸着点の形成に依存するので、この方法は、 通常はポリマー マイクロスフェアとタンパク質との吸着に用いられます。 また、物理吸着は、一般にハイブリダイゼーション・ベースのアプリケーションでホルモン、 ペプチド及び核酸には不向きで、更に、シリカへのタンパク質の物理吸着は、 ポリマー マイクロスフェア の場合よりも効率的で無いことが知られています。物理吸着によるタンパク質のマイクロスフェアへのコーティング方法は、 懸濁試薬による定量分析よりはむしろ、乾燥試薬を特徴とするフォーマット (例:メンブラン上にビーズ(粒子)が乾燥されている ラテラルフロー試験等)に限られていることが多いです。 Tech Notes 201及び 204参照。

カップリング法

共有結合によるカップリングにより、タンパク質などの生体分子とカルボキシル基や アミノ基で修飾されたマイクロスフェアとの永久的な結合が得られます。 本法は、検体に特異的に反応するビーズが混合されたマルチプレックス・アッセイ等の 市販用試薬を開発する際に要求される高い安定性を提供できます。 更に、立体効果を得たり、分子を最適な方向に向けたりする為に、 特別なリンカーを使用する事は可能です。共通結合プロトコルは、 他のアプローチよりも高度な最適化を持ちが可能で、 PolyLink,等のカップリング用キットにより共有結合生成プロセスを簡略化出来ます。 Tech Notes 201205参照

アフィニティー結合

アフィニティー結合は、1次抗体やビオチン化分子を固定するための簡単な方法です。 プロテインA、プロテインGやFC部位結合抗体の 粒子表面へのコーティングは、1次抗体の結合部位を粒子の外側に向けて適切に配向し、ストレプトアビジンは、 抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドの様なビオチン化分子の結合に広く使用されます。Tech Notes 101302参照

アッセイ用 対応する磁性粒子
イムノアッセイ ProMag™ HP
ケミルミネッセンス ProMag™,   ProMag™ HP COMPEL™BioMag®
ハイブリダイゼーション・アッセイ ProMag™,   ProMag™ HPCOMPEL™
フローサイトメトリー COMPEL™
それぞれの結合方法には、利点と限界があることにご注意下さい。また、研究目的の状況や使用された試薬に対する要求の比較検討を行う必要がある場合があります。
生体分子 コーティング方法 注意点
ペプチド 共有結合 ストレプトアビジン/ビオチン エンドポイント固定によりペプチドの活性を保持
核酸 共有結合 ストレプトアビジン/ビオチン エンドポイント固定によりターゲット・シークエンスのハイブリダイゼーションが可能
タンパク質(抗体等) 共有結合、物理吸着 ストレプトアビジン/ビオチン 例えば抗体の様な一般的なたんぱく質は、複数の吸着点を持つには十分大きく、 非特異的な配向により活性を損ないません。しかし、特定なリンカーやスペーサーが、 立体効果や配向を最適化する為に必要になる場合があります。
粒子の洗浄

洗浄は、バッファー系を正常化する為に必要に応じて行われ、 リガンドのコーティング 又は活性を妨害する残渣の除去や、コーティングの連続ステップにより移行したマイクロスフェアの除去、 或いは専用プロトコルを使用します。

レア・アースや磁気セパレーターは、磁性マイクロスフェアの洗浄に使用されます。 詳細は、磁性ビーズ用セパレーターをご覧ください。

磁気を持たない粒子の場合には、洗浄方法は、粒子径と処理能力の両方を念頭に置いて選択する必要があります。 遠心沈降法は、一般に0.5um以上の粒子に使用され、遠心フィルター装置、浸透、或いは、 クロスフローろ過法は、一般に0.5um以下の粒子に適応されます(Cat#AA022, Vivaspin 2mL Ultrafiltration Device)。

洗浄を1回行う場合の例
・マイクロスフェアの分離/静置/遠心分離
・上澄み除去
・バッファーによるマイクロスフェアの再分散

上記を2〜3回繰り返します。詳細は、Tech Notes 203 “Washing Microspheres”参照

粒子の凝集

Bangs社のマイクロスフェアは、ポリスチレンポリメチルメタクリレートシリカを含む色々な材質が利用できます。 ポリマーマイクロスフェアは、疎水性相互作用による凝集に敏感で、幾つかのファクターが 懸濁液の分散性に影響する場合があります。例えば、低表面電荷、粒径が非常に小さい場合 (高表面積:体積比)、高粒子濃度、最適ではないバッファー成分及び不適切なpHは、 粒子の凝集を引き起こす場合があります。この様な場合には、凝集防止に効果のある方法で 処理します。例えば、疎水性を低減する為に界面活性剤の使用(例:0.01〜0.1%Tween® 20 又はSDS)、 凝集を壊して分散させるための超音波分散や回転式分散の実施、個々の粒子同士の接触を 低減させるために粒子濃度やバッファー中のpHの調整等があげられます。詳細は、 Tech Notes 202 参照

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