繝・け繝弱Ο繧ｴ サーモフィッシャーサイエンティフィック:ピアスサーモフィッシャーサイエンティフィック:ピアス
螳牙ｮ壼酔菴堺ｽ薙い繝溘ヮ驟ｸ縺ｫ繧医ｋ陋狗區雉ｪ逋ｺ迴ｾ螳夐㍼
SILAC Protein Quantitation Kits
Stable isotope labeling using amino acids in cell culture (SILAC)
Top page 繝斐い繧ｹ遉ｾ陬ｽ蜩∫ｴｹ莉・ height=
Stable isotope labeling using amino acids in cell culture (SILAC Kit) 環境・刺激・疾病などにより細胞機能の変化に伴い、蛋白質の発現量も影響を受けることがあります。この機能変化に伴う蛋白質発現レベルを定量的に測定することで細胞機能の研究に有用な情報を得ることができます。SILACは発現量の変化を定量する手法として既に確立された強力な手法であり安定同位体の 13C- や 15N- で標識されたアミノ酸を細胞培養液に添加することで安定同位体標識蛋白質をin vivo発現させ、質量分析により定量的に測定する手法です

特徴
  • 生細胞で同位体標識は蛋白質に100％導入
  • 試料調製により生じる測定内誤差を回避（MS分析でのシグナル強度のバラツキ）
  • リジンとアルギニンを介した確実な２重の同位体標識
  • DMEM または RPMI 1640 培地での増殖に適した培養細胞 (HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3, Jurkat) に対応

SILAC アプリケーション:
  • 異なる細胞処理による蛋白質の相対的存在量比を定量的に解析
  • 特異抗体のない蛋白質の定量的解析
  • 正常細胞vs疾病細胞の蛋白質発言プロファイリング
  • 数百～数千の蛋白質の同定・定量

Figure 1. Schematic of SILAC workflow.
図 1. SILAC法スキーム
0.1 mg/ml 13C6 L-lysine-2HCl または 12C6 L-lysine-HCl を含む 10% dialyzed FBSを追加した SILAC DMEM (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Pro.# 89983) を使用して、 DMEM培地に適した A549 細胞を6継代 (10日間) 増殖させた。同位体標識後、13C6 L-lysine-標識細胞のみを 5 uM カンプトテシン (Sigma, St. Louis, Pro.# C9911) により24時間処理した。両細胞群は M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Pro.# 78501) により溶解、細胞ライゼートのPierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, Pro.# 23225)による蛋白質総定量を行った。蛋白質量で標準化した各細胞ライゼート 50 μg を等量ずつ混合した後、4-20% SDS-PAGE に供した。ゲルはGelCode Blue Stain Reagent (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Pro.# 24592) により染色、Pierce In-Gel Tryptic Digestion Kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Pro.# 89871)による蛋白質の消化・アルキル化を行いLTQ Orbitrap Hybrid Mass Spectrometerによる質量分析に供した。


SILAC法では特定のアミノ酸を欠乏した特別な培地での細胞の増殖が必要になります。欠乏したアミノ酸の同位体アナログ（例； 13C6 または 12C6）を添加することにより補償します。コントロール細胞群を12C6アミノ酸添加培地で増殖させ、実験系の細胞群は13C6アミノ酸添加培地で増殖させるのが典型的な実験例です。
細胞内の蛋白質合成により同位体標識アミノ酸は蛋白質の1次構造に導入されます。化学的処理や遺伝学的処理による実験系細胞群のプロテオーム変化の後、両細胞群から回収した等量の蛋白質を混合してSDS-PAGEによる分離を行いトリプシン消化とMS分析を行います。12C6 および 13C6 L-lysineのどちらで標識されたペプチドも化学的に同一なので、逆相カラムによる分画では共に溶出して、MS分析では同時に検出されます。細胞群間の蛋白質存在量の変化は、同位体標識ペプチドの質量スペクトルの相対的なピーク強度から決定します(図1)。
キットはDMEMまたはRPMI1640培地での増殖に適した培養細胞に対応します。各キットには培地、13C6 および 12C6同位体標識アミノ酸、透析済み血清を含む細胞の同位体ラベルに必要な試薬が含まれます。別途購入可能な13C6 15N4 L-Arginine はPierce SILAC Protein Quantitation Kits と組合せることで検出率 (peptide isotope label coverage)を増強することができます。さらに蛋白質濃縮/単離キットと組合せて使用することで、細胞表面蛋白質やオルガネラ局在蛋白質、リン酸化やグリコシル化などを受けた翻訳後修飾蛋白質の解析にも対応します。

データ：
Pierce SILAC Quantitation KitによりA549細胞に13C6 L-lysine を標識(98%以上の導入率)しました。13C6同位体で標識した細胞はカンプトテシン処理を行った後、溶解しました。13C6細胞ライゼートはコントロール細胞ライゼートと混合した後、SDS-PAGEにより分離、その後トリプシン消化フラグメントのMS分析を行いました。350以上の蛋白質をThermo Scientific Scientific Finnigan LTQ Orbitrap Mass Spectrometer を使用したMS/MSにより同定、同定したペプチドはThermo Scientific Bioworks Software Suite により定量解析を行い、蛋白質存在量の相対的変化に対応するSILAC比を求めました。 同定された蛋白質の殆どでは、カンプトテシン処理(図2)による蛋白質レベルの変化が見られませんでした。13％の蛋白質に関しては13C6細胞でコントロール細胞と比較して1.5倍の高い蛋白質レベル（SILAC比）が確認、6％以上の蛋白質ではカンプトテシン処理後に蛋白質レベルの減少もみられました。最も有意にアップレギュレートされた15蛋白質(表1)をMSで同定しました。 カンプトテシン処理によるアップレギュレートが確認された蛋白質のひとつにDNA修復蛋白質 PCNA (proliferating cell nuclear antigen) がありました(図3)。SILACデータを検証するために別途ウエスタンブロットによる定量(図4)も行いました。PCNA蛋白質レベルは1.9倍に増加しましたが、ハウスキーピング蛋白質GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) には有意の変化は見られませんでした。ウエスタンブロットにより決定された存在比はSILAC(表1)により決定された存在比と類似していました。
The Thermo Scientific LTQ Orbitrap Hybrid Mass Spectrometer 迅速で信頼性の高い蛋白質の検出と同定を可能にします。高解像、高精度の質量分析によりSILACやプロテオミクスやメタボロミクス、また低分子の研究に優れたデータを提供します。
※ｻThe purchase of this product conveys a non-transferable license to the Purchaser to use this product in methods protected under U.S Patent 6,653,076 (owned by University of Washington) for research purposes only.
References
  1. Blagoev, B., et al. (2004). Nat Biotechnol 22(9): 1139-1145.
  2. Cox, J. and M. Mann (2007). Cell 130(3): 395-398.
  3. Kratchmarova, I., et al. (2005). Science 308(5727): 1472-1477.
  4. Mann, M. (2006). Nat Rev Mol Cell Biol 7(12): 952-928.
  5. Olsen, J. V., et al. (2006). Cell 127(3): 635-648.
  6. Ong, S. E., et al. (2002). Mol Cell Proteomics 1(5): 376-386.


：取扱説明書　：MSDS(英語版)
Cat # 製　　　品　　　名 Pkg. Size
89982 Pierce SILAC Protein Quantitation Kit-RPMI Kit
SILAC RPMI Media 2 x 500 ml
Dialyzed FBS 2 x 500 ml
13C6 L-Lysine-2HCl 50 mg
L-Lysine-2HCl 50 mg
L-Arginine-HCl 2 x 50 mg
1 kit
89983 Pierce SILAC Protein Quantitation Kit-DMEM
SILAC DMEM Media 2 x 500 ml
Dialyzed FBS 2 x 500 ml
13C6 L-Lysine-2HCl 50 mg
L-Lysine-2HCl 50 mg
L-Arginine-HCl 2 x 50 mg
1 kit
89984 SILAC RPMI Media 500 ml
89985 SILAC DMEM media 500ml
89986 Dialyzed FBS 50 ml
89987 L-Lysine-2HCl 50 mg
89988 13C6L-Lysine-2HCl 50 mg
89989 L-Arginine-HCl 50 mg
89990 13C6 15N4L-Arginine-HCl 50 mg

縺薙・繝壹・繧ｸ縺ｮ繝医ャ繝励∈

製品情報は掲載時点のものですので、ご覧いただくタイミングにより製品情報が変更されている場合があります
繝・け繝弱Ο繧ｴ
〒13-0021 東京都文京区本駒込1-27-9
TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306
繝｡繝ｼ繝ｫ縺ｯ縺薙■繧峨∈ info@technochemical.com