[ピアス]サーモフィッシャーサイエンティフィック Photoreactive Amino Acids

アミノ酸ジアジリン誘導体による生細胞内標識とin vivoリアルタイムUV架橋

L-Photo-Leucine および L-Photo-Methionine (図1) はアミノ酸誘導体であり、生合成の際に蛋白質の1次構造に導入されます。発現された蛋白質は紫外線照射により生細胞内のネイティブな環境下で相互作用ドメイン間の共有結合が行われます。

図1. L-Photo-Leucine および L-Photo-Methionine および各々の天然型アミノ酸
この手法は細胞生物学的に見て不都合な異物(化学架橋剤や関連の有機溶媒)を外部から細胞に導入する必要もなく、細胞内の安定な相互作用や一過性の相互作用を細胞内で、リアルタイムにクロスリンク(図2)します。

図2. 光反応性アミノ酸を用いた蛋白質相互作用検出プロトコル概要

特徴 In vivo標識 - 通常の細胞機構により光反応性アミノ酸は生細胞内で蛋白質に導入 In vivo 架橋 - ネイティブな細胞環境下で蛋白質相互作用を検出利便性 - Photo-Leu および Photo-Metは通常のラボ光源で安定、遮光下の作業は不要特異性 - 相互作用蛋白質間を結合ドメイン界面でクロスリンク回収率 - 架橋反応後の細胞ライゼートからの蛋白質回収率90% 細胞 - HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3, C6 を含む細胞ラインで架橋
LeuおよびMetが欠如した、特別に調整された培地(#30030 DMEM-LM 等)と組合せて使用することで、アミノ酸誘導体のPhoto-Leu および Photo-Metは細胞内の蛋白質合成機構で天然型アミノ酸と同様に扱われます。結果、蛋白質の1次配列中のLeuおよびMetに置換されます。Photo-Leu および Photo-Met アミノ酸誘導体には紫外光に暴露すると近傍のアミノ酸の側鎖や主鎖と共有結合を形成する反応性中間体となるジアジリン環が含まれます。細胞内で会合している結合パートナーは培養細胞中で速やかにジアジリン含有蛋白質に捕獲されます。架橋された蛋白質複合体はSDS-PAGE後のウエスタンブロットでの分子量シフト、サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配法、質量分析などにより検出できます。

表1. UVランプと照射条件
UV ランプ	波長および出力	UVAアウトプット 1cm照射	光反応性アミノ酸半減期	推奨照射時間
UVP-3UV	365 nm, 8 W	2800 mW/cm²	4 min	16 min
Stratalinker 2400	365 nm, 15 W	3000 mW/cm²	3 min	12 min
Spectroline XX-15A	365 nm, 15 W	3500 mW/cm²	2 min	8 min
UVP UVGL-58	365 nm, 6 W	2300 mW/cm²	5 min	20 min
UVP UVMLS-38	365 nm, 8 W	2800 mW/cm²	4 min	16 min

Western blotting results of photoreactive amino acid protein interaction experiments.

図3. 光反応性アミノ酸とホルムアルデヒドを使用した架橋による相補的な蛋白質相互作用解析

各HeLa細胞ライゼート10mgをSDS-PAGEで分離、HSP90, STAT3, Ku70, Ku86特異抗体によるウエスタンブロットに供した。下部のパネルはコントロールのβアクチン(上部バンド)とGAPDH (下部バンド)。L1; mock処理
L2; 1% ホルムアルデヒド処理(10min)
L3; Photo-Met および Photo-Leu で処理後UV照射

References:

Bomgarden R.D., et al. (2007). In vivo crosslinking strategies to identify and characterize transcription factor protein complexes.[abstract] In: Proceedings of the 100th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2007 Apr 14-18; Los Angeles, CA. Philadelphia (PA): AACR; 2007. p 141. Abstract nr 1192.
Suchanek, M., et al. (2005). Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions. Nat. Methods 2(4):261-267.
Vila-Perello, M., et al. (2007). Covalent capture of phospho-dependent protein oligomerization by site-specific incorporation of a diazirine photo-cross-linker. J. Am. Chem. Soc., 129(26):8068 -8069.

注）操作には以下の4製品が全て必要になります。

　：取扱説明書　　

　：MSDS(英語版)

Cat #	製　　品　　名	Pkg. Size
22610	L-Photo-Leucine (L-2-amino-4,4'-azi-pentanoic acid)	100 mg
22615	L-Photo-Methionine (L-2-amino-5,5'-azi-hexanoic acid)	100 mg
30030	Dulbecco's Modified Eagle's Limiting Medium (DMEM-LM) Sterile filtered (-)L-leucine, (-)L-methionine with 4.5 g/ L-glucose,4.0 mM L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red	500 ml
89986	Dialyzed FBS	50 ml

製品情報は掲載時点のものですので、ご覧いただくタイミングにより製品情報が変更されている場合があります。

〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9
TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306

info@technochemical.com