ゲルシフト法 (EMSA：electrophoretic mobility shift assay) はDNA-タンパク質間の相互作用検出の強力なツールです。この手法はDNA(protein-free)とDNA-protein複合体との電気泳動での移動度の違いを利用しています。サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドの LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit は、サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランド独自の化学発光検出技術による非放射性標識系のEMSAキットです。 Biotin 3' End DNA Labeling Kit (#89818) によりビオチン標識したDNAやカスタム合成により作製したビオチン修飾オリゴを使用するため、プローブの安定性や放射性廃棄物などの問題も無く、放射性標識アッセイに匹敵する感度で迅速にアッセイを行うことが出来ます。 キットにはDNA-protein結合反応100回分に必要な試薬と800 cm2 分のメンブランを検出するのに充分な化学発光基質が含まれます。（＊ナイロンメンブランとDNA 3’末端ビオチン標識キットは別売りです。） 特徴 ストレプトアビジン-HRP標識と化学発光基質による検出 検出感度はRI法(32P)に同等、ビオチン標識プローブは1年以上安定 4.5‐5 時間（#89818 によるビオチン化を含む）で検出可能 3'末端へのビオチン標識（#89818）反応か標識済みオリゴが必要 核タンパク質抽出試薬 NE-PER (#78833) ライセート利用可能 図1. 感度比較 LightShift®の感度を、従来の放射性標識(32P-標識)法およびジコキシゲニンによる化学発光法をベースにした他社EMSAキットと比較した。系列希釈した標識DNA(二本鎖)を6%ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、各製造元の取扱説明書に従って検出した。50アットモル以下での比較可能な感度はLightShift®および放射性標識アッセイ(2,000 cpm 32P/femtomole)で50アットモル以下に達したが、32P-標識DNAではより長い感光が必要であった。同じ感光時間で行った化学発光検出ではLightShift®はジゴキシゲニンの約8倍の感度であった。 図2. LightShift 化学発光 EMSA と 放射性 (32P) EMSA. 転写因子Oct-1に対する結合シーケンスを含む22 bpの二本鎖DNAを、LightShiftキットと他社ジゴキシゲニンEMSAキットでの検出用に標識し、放射性標識アッセイではT4ポリヌクレオチドキナーゼにより32P-標識(40,000 cpm/reaction)した。結合反応には20 fmolのDNAをNE-PERにより抽出した2 ul (6.8 ug) のHela細胞核抽出物と共にインキュベーションして行った。200倍モル過剰の未標識DNAを含む競合反応はDNA-protein相互作用の特異性を示すために行った。電気泳動は6%ポリアクリルアミドゲルで行い、化学発光検出では陽電荷ナイロンメンブランに転写して、各製造元のプロトコルに従い検出した。 放射性標識EMSAでは、スクリーンを使用してゲルから直接X線フィルムに感光させた。 図3. NF-ｋBのDNA結合特性の最適化 NF-ｋBに対する結合配列を含む22 bpの二本鎖DNAとHela細胞核抽出物のゲルシフトアッセイをLightShift®キットで行った。様々な添加物がシフトパターンに与える効果は最適結合条件や特異的結合条件やDNA-protein相互作用の強度の決定に有用である。フィルムの感光は5分間で行った。 References Fried, M. and Crothers, D.M. (1981). Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacylamide gel electrophoresis. Nucl. Acids Res. 9, 6505-6525. Revzin, A. (1989). Gel electrophoresis assays for DNA-protein interactions. BioTechniques 7, 346-354. 　：取扱説明書　　　：MSDS(英語版) Cat # 製　　品　　名 Pkg. Size 20148 LightShift Chemiluminescent EMSA Kit 100回の結合反応と〜800 cm2 分のメンブレンでの検出分の試薬 LightShift EMSA Optimization and Control Kit (20148X) 10X Binding Buffer 1 ml Biotin-EBNA Control DNA 50 ul Unlabeled EBNA DNA 50 ul EBNA Extract 125 ul Poly (dI･dC) 125 ul 50% Glycerol 500 ul 1% NP-40 500 ul 1 M KCl 1 ml 100 mM MgCl2 500 ul 200 mM EDTA pH 8.0 500 ul 5X Loading Buffer 1 ml Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (89880) LightShift Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate 1.5 ml LightShift Luminol/Enhancer Solution 80 ml LightShift Stable Peroxide Solution 80 ml LightShift Blocking Buffer 500 ml LightShift 4X Wash Buffer 500 ml LightShift Substrate Equilibration Buffer 500 ml Kit 製品情報は掲載時点のものですので、ご覧いただくタイミングにより製品情報が変更されている場合があります。 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com