[サーモサイエンティフィック]PIERCE リン酸化タンパク質の濃縮

特異性 - 低レベルに抑えられた非特異的蛋白質の夾雑
迅速 - 2時間以内に濃縮できる効率的スピンフォーマット
優れた収率 -　細胞ライセートや組織抽出物など生物学的試料からの高い収率（典型的な収率；10-25％）
利便性 - 充填済みスピンカラム・バッファー類・試薬類・限外ろ過デバイスを含む完全キット
対応アプリケーション - 質量分析、ウエスタンブロット、2次元電気泳動

リン酸化は蛋白質で最も頻繁に生じる翻訳後修飾の一つであり、シグナル伝達・蛋白質相互作用・蛋白質の安定性・蛋白質の局在性・アポトーシス・細胞サイクルを含む、ほぼ全ての細胞内の生物学的イベントを制御しています。リン酸基は一過性で不安定な状態にあり蛋白質リン酸化における変化の検出は困難な課題のひとつといえます。さらにリン酸化蛋白質の存在量の低さやリン酸化抗体が少ないこともリン酸化蛋白質の検出を困難にしています。近年の質量分析技術の発達と固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(IMAC)によるリン酸化蛋白質の濃縮の組合せによりホスフォプロテオームにおける解像度は飛躍的に向上しました。

Pierce Phosphoprotein Enrichment Kitは(哺乳動物)細胞または組織からのリン酸化蛋白質の効率的な濃縮を目的に開発されました。独自の金属/バッファー組成により、非特異的結合を無視できる程度に抑えつつ、優れた収率を可能にしました。利便性の高いスピンフォーマットを採用、ウエスタンブロット, MS, 2D-PAGE, アレイなどの下流アプリケーションに対応します。

表1. リン酸化蛋白質の収量と濃縮時間の比較
キット	収率 (%)	濃縮時間 (Hours)
Thermo Scientific Pierce® Phosphoprotein Enrichment Kit	15	1.5
Competitor Q Kit	4.4	4.5
Competitor I Kit	2.6^††	3.5
Competitor C Kit	8	3
Competitor E Kit	Too dilute to determine	5
†† Based on maximum 1 mg load per manufacturer’s protocol


	Phospho－MAPK T202/Y204
	Phospho-PTEN S380
	Phospho-GSK3b S9
	Phospho-MAPK T202/Y204
	Phospho-Akt S473
	Phospho-Src Y527
	Cytochrome C
	p15Ink 4b

図 1: Pierce Phosphoprotein Enrichment Kitによるリン酸化蛋白質の濃縮血清枯渇HeLa細胞およびNIH3T3細胞を EGF (100 ng/ml, 10 minutes) および PDGF (50ng/ml, 20 minutes) でそれぞれ刺激した。リン酸化蛋白質の濃縮は2 mgの細胞抽出物から行った。濃縮された通過画分、洗浄画分、溶出画分をSDS-PAGEにより分離した。各レーンは蛋白質濃度により均一化して、10 ug/laneで添加した。ウエスタンブロット解析は部位特異的リン酸化を検出する抗体により行った。シトクロームC (pI 9.6) および p15Ink4b (pI 5.5) は非リン酸化蛋白質の非特異的結合を確認するための陰性コントロールとした FT=通過画分 W=プールした洗浄画分 E=プールした溶出画分 L=未濃縮の細胞抽出物


	Phospho PTEN S380
	Phospho MAPK T202/Y204
	Phospho GSK3b S9

図 2: Pierce Phosphoprotein Enrichment Kit の特異性未処理またはλホスファターゼにより脱リン酸化されたHeLa細胞抽出物 (2 mg)を別々に Phosphoprotein Enrichment columnsに添加した。濃縮された溶出画分はSDS-PAGEにより分離した。各レーンは蛋白質濃度で均一化(10 µg/lane)した。（カラムの）濃縮（効果）を確認するため、未処理またはλホスファターゼ処理した細胞抽出物（未濃縮）を各ゲルに添加した。ウエスタンブロット解析はRas-MAPKおよびPI3K-Aktシグナルカスケードで重要な蛋白質を認識するリン酸化抗体で行った。


	Phospho PTEN S380
	Phospho-Rb S795
	Cytochrome C

図 3: Pierce Phosphoprotein Enrichment Kit によるマウス肝組織ホモジネートからの濃縮約2 mgのマウス肝組織ホモジネートをPhosphoprotein Enrichment columnに添加した。濃縮された通過画分、洗浄画分、溶出画分をSDS-PAGEで分離した。各レーンは蛋白質濃度で10 ug/laneに均一化した。ウエスタンブロットには部位特異的リン酸化を検出する抗体を使用した。