[ピアス]サーモフィッシャーサイエンティフィック MS分析用銀染色キット

質量分析法はタンパク同定における強力な手法として利用されています。2次元電気泳動ゲルの銀染色はマスフィンガープリント法による特異的タンパク質の同定へと続く一連の操作で重要な中間ステップであり、銀染色の感度とMSの分析能力は常に研究者の関心の的となっています。
サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドは研究者が求める製品は単にMS分析アプリケーションへの対応ではなくベストな結果を提供すべく最適化されている製品であることを知っています。従来のSilverSNAPキットを再調整して、MS分析アプリケーション用に目的を絞り、柔軟・確実・最上なキットの開発を目指しました。MS分析用 SilverSNAP は、効果的なゲル脱染色とMS分析に最適化されたプロトコルを備え、検出感度・タンパク回収・MS分析において有利な条件を備えたキットです。

特徴

固定後30分間以内にスポットあたり0.25ngのタンパクを検出するサブナノグラム域の感度と低いバックグランド
スポットは1時間以内に脱染色とトリプシン消化が可能
1Dおよび2Dゲルからの優れたMS 分析能（特にMALDI-MSでは優れた結果）
MS分析前の銀染色から脱染色までに必要な試薬類が500スポット分
固定は 15-30 分間（オーバーナイトも可能）、染色は 1-30 分間 (通常 2-3 分間)
染色が困難なlysoyme (pI 10) や chymotrypsinogen A (pI 9.2)などの塩基性タンパクにも効果的（それぞれ 0.2 ng と 0.5 ng から検出）
室温での保管も可能

SilverSNAP Stain for Mass Spectrometryゲル固定化後の染色と脱染色

1. 10% EtOHによるゲル洗浄（2回）　・続いて純水により2回洗浄　　（各5分間）	2. ゲルの増感 (enhance) 　・増感剤：純水を1:500 混合　・ゲルの増感（1分間）　・純水により2回洗浄(1分間)	3. 銀染色 (stain) 　・増感剤：染色剤を 1:100 混合　・5分間インキュベーション　・純水による洗浄

4. ゲルの現像（develop）　・増感剤：展開剤を1:100混合　・純水で2回洗浄 (各20秒) 　・展開剤の添加（2-3分間）	5. 現像の停止　・5% 酢酸の添加（10分間）　・純水による洗浄	ゲルからのスポット切り出しと脱染色の準備完了

6. 切り出したスポットの脱染色　・ゲル片を0.5mlのマイクロチューブに移す　・脱染色用の反応液 (DWS) を調製 a) 200 μl の DWS を各ゲル片に添加　b) 穏やかに攪拌、15 分間のインキュベーション　(Repeat a. and b.above)

7. ゲル内消化の準備　・25mM NH4HCO3:50%AcCNにより3回洗浄　(各10分間) 　・ゲル内でのトリプシン消化

		SilverSNAP Stain for MS			Competitor I MS Stain			GelCode Blue Stain Reagent
Protein	Amnt (ng)
BSA	50	63	13	21	53	6	11	40	7	18
Ovalbumin	50	40	5	13	44	1	2	42	1	2
Chymo-trypsinogen A	50	47	4	9	41	2	5	41	1	2
Myoglobin	50	32	6	19	31	3	10	38	1	3
表1. Sequence Coverage Comparison BSA、Ovalbumin、Chymotrypsinogen A、Myoglobinを各50ngずつ分離用SDS-PAGEゲルに添加した。電気泳動後、それぞれのゲルをSilverSNAP Stain for Mass Spectrometryにより染色し、競合他社のMS対応銀染色とGelCode Blue Stain Reagentによる染色と比較を行った。バンドは切り出され、脱染色が施され、 The resultant bands were excised and destained,トリプシン消化 (Product #89871) の対象とし、MALDI/MSによる分析用に調製した。ゲル内トリプシン消化前に還元・アルキル化は行わなかった。結果の要約は上表に示す。サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドの SilverSNAP Stain for Mass Spectrometry は全てにおいて優れたまたは同等の結果を示した。

図 1 . ラットミトコンドリア抽出物の2次元電気泳動分析
ラットミトコンドリアからの抽出物を調製し、同一条件の2次元電気泳動条件下で添加・分離を行った。全てのゲルは5-8のpH勾配で泳動し、それぞれのゲルを SilverSNAP Stain for Mass Spectrometry (図)、競合他社製品、GelCode Blue Stain Reagentで染色した。10スポットに関して、全ての染色条件下で充分に染色されていることが確認された。これらのスポットをゲル内消化とMS分析に使用した。

ラットミトコンドリアタンパク2次元電気泳動解析のペプチドマスフィンガープリント法によるバイオインフォマティックスDATA

2-D Spot #	同定されたタンパク質	染色方法
1	ATP Synthase, H+ transporting, Mitochondrial F1 complex, Beta subunit	ALL
2	AJ18 Protein	SilverSNAP Stain for MS and GelCode Blue Stain Reagent
2	ATP Synthase, H+ transporting, Mitochondrial F1 complex, Subunit d	Competitor I
3	Electron Transfer Flavo Protein (ETF Protein)	ALL
4	H+-Transporting two-sector ATPase (EC 3.6.3.14) Alpha chain precursor	SilverSNAP Stain for MS and GelCode Blue Stain Reagent
4	Unknown Protein for MGC:93808	Competitor I
5	Mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor	ALL
6	Glutamate dehydrogenase 1	ALL
7	Glucose regulated protein, 58 kDa, ER-60 Protease	ALL
8	Enoyl coenzyme A Hydratase, short chain mitochondrial	SilverSNAP Stain for MS and GelCode Blue Stain Reagent
8	Translocase of inner mitochondrial membrane homolog 44	Competitor I
9	Enoyl Coenzyme A hydratase short chain Mitochondrial	ALL
10	ATP Synthase, H+ transporting, Mitochondrial F1 complex, Beta subunit	ALL
表 2. ペプチドフラグメントマッピングにより同定された全てのタンパク質は、ミトコンドリアタンパク質として既知のタンパクであった。MALDI- Ion Trap MSはAgilent Technologies LC/MSD Trap XCTにより行った。図1で示されたスポットはミトコンドリア抽出物から同一条件で泳動に供された2Dゲルから切り出された。SilverSNAP for MS、他社銀染色製品、GelCode Blueにより染色されたゲルからのスポットは、それぞれ還元・アルキル化・トリプシン消化に供した。トリプシン消化はサーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドIn-Gel Tryptic Digestion Kit (#89871)を使用して行われた。ペプチドマスフィンガープリントは ProteinProspector により行った。

　：取扱説明書　　

　：MSDS(英語版)

Cat #

製　　品　　名

Pkg. Size

24600

SilverSNAP Stain for Mass Spectrometry

ミニゲル(8 cm x 8 cm) 20枚分の銀染色とMS分析のための500スポットからの脱染色に充分な試薬類を含む
SilverSNAP Sensitizer	2 ml
SilverSNAP Stain	500 ml
SilverSNAP Developer	500 ml
SilverSNAP Enhancer劇	25 ml
Silver Destain Reagent A	4 ml
Silver Destain Reagent B	14 ml

Kit

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