夾雑物によるSDS-PAGEバンドの歪みを解消します 進化した PAGEprep® Advance Protein Clean-up and Enrichment Kit はSDS-PAGE分析が困難であった試料のクリーンアップと濃縮をより効果的に行います。泳動バッファーやSDS-PAGE分離には共存不可な阻害物質が多数存在します。例えば、6Mグアニジン塩酸塩を含むタンパク質試料をLaemmliバッファーに混合すると沈殿が生じます。高濃度の界面活性剤もSDS-PAGEでのバンドの歪みを生じます（図1）。PAGEprep Advance Kit はスピンカップ採用の短時間の精製・濃縮で、カオトロピック試薬・界面活性剤・脂質・pH・塩などの阻害因子を除去します。 図 1. 界面活性剤によるバンド歪みの解消 Rat C6 細胞を可溶化し膜タンパク質フラクションをMem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent (#89826).により分画・調製した。PAGEprep処理もしくは未処理の、各細胞フラクション（膜タンパク質フラクションと水溶性フラクション）は4-20% グラジエントゲルによりSDS-PAGEに供して分離した。ウェスタンブロットはCOX4（シトクロームオキシダーゼサブユニット4）抗体と化学発光基質SuperSignal® West Femto Chemiluminescent Substrate (# 34095)により行った。PAGEprep Kitにより処理された試料のバンドは未処理の試料に比べて、良好な直線性と解像度を示した。　S = Soluble fraction (hydrophilic), M = Membrane 特徴 染料、還元剤、界面活性剤、糖、グリセロール、グアニジン、ウレア、硫安を除去 20分間以内に70ugまでのタンパク質を含む試料(2-350ul)を8倍まで濃縮 PAGEprep®処理後のBCAアッセイによる定量も可能 再現性の高いSDS-PAGE分析 新採用スピンカップ方式、迅速で効果的 70ugまでのタンパク質を含む2-350ulの試料を、20ulのPAGEprep® Advanceレジン（modified diatomaceous earth）と混合して使用します。DMSOを添加することでタンパク質はレジンに結合しますが、未結合の夾雑物質はスピンカップから洗浄・除去されます。結合させたタンパク質は50ulの溶出バッファーにより溶出されます。この溶出バッファーの組成はBCAアッセイに対応しているので、必要であれば一部を分取してBCAタンパク質定量も行うことが出来ます。溶出した試料はキットに含まれる5×サンプルバッファーや他のサンプルバッファーと混合して、続くSDS-PAGE分析を行うことが出来ます。スピンカップ方式を採用したPAGEprep® Advance Kitは従来のPAGEprep(バッチ方式)に比べて、より迅速で効果的でロスの少ない、改善された回収率とキャパシティを実現しました。プロセスは20分以内に完了し、70ugまでの殆どのタンパク質で約70-85％の回収率となります。 図 2. PAGEprep Advance Kitによるタンパク質の回収率 様々な分子量 (30K, 44K, 80K, 86K, 12K, バクテリアライセート 27K) の精製タンパク質 (60ug) をPAGEprep Advance Kitにより処理した。 タンパク質の濃度はBCA Protein Assayにより決定し回収率（%）を算出した。 PAGEprep® Advance Kitによるサンプル処理の例 グアニジン塩酸塩により可溶化されたインクルージョンボディ（封入体） 低pHバッファー、チオシアネート、ウレアを含むサンプル 硫安沈殿させたタンパク質 希薄なタンパク質サンプル 表 1. 一般的なSDS-PAGE阻害物質とのコンパチビリティ 阻害物質 タンパク質の回収率 (開始量 = 20 ug BSA) Control (Water) 75% 0.5 M Sodium Chloride 80% 2 M Ammonium Sulfate 76% 20% SDS 75% 10% Triton* Detergent 75% 6 M Urea: DMSO (1:3 ratio) 75% 1M Sodium Chloride 75% 6M Urea 74% 10% CHAPS 80% 25% Glycerol 71% 10% OTG 71% 2 M Guanidinium?HCl 70% 40% Sucrose 70% 　：取扱説明書　　　：MSDS(英語版) Cat # 製　　品　　名 Pkg. Size 89888 PAGEprep® Advance Clean-Up Kit 50回分の試薬 PAGEprep Protein Binding Resin 1 ml 溶出バッファー 5.0 ml 高純度DMSO 27 ml スピンカップ 50 コレクションチューブ 72 レーンマーカー 5 ml 非還元型サンプルバッファー(5X) Kit 削除品 26800 PAGEPrep® Protein Clean-Up and Enrichiment kit #89888が代替え品となります。 Kit 製品情報は掲載時点のものですので、ご覧いただくタイミングにより製品情報が変更されている場合があります。 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com