[ピアス]サーモフィッシャーサイエンティフィック POD用化学蛍光基質

ELISAアッセイでのパーオキシダーゼ活性の検出には様々な基質が利用されます。TMB, OPD, ABTSなどの発色基質は広く使用されている基質ですが、検出感度や検出域やシグナルノイズ比などのパフォーマンスに関しては、各基質間で全く異なります。もし、基質安定性、感度、S/N比が高く、かつダイナミックレンジの広い、反応型(エンドポイント/カイネティック)も選べる基質があれば、それが理想的です。

その理想的な基質のひとつが、サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドの QuantaBlu^TM Fluorogenic Peroxidase Substrate です。パーオキシダーゼとの反応で生成する、蛍光退色しない非常に安定な青色蛍光産物(EX.325nm/Em.420nm)を蛍光測定するQuantaBluはフレキシブルな反応時間、反応温度の選択により広範なダイナミックレンジを実現しました。

蛍光測定による検出法は、一般的に検出域が4ユニット以上にわたる定量が難しい発色基質での検出限界を上回ります。QuantaBlu^TM はエンドポイントアッセイ、カイネティックアッセイで使用でき、反応はRTまたは37℃で1.5分間～90分間となります。パーオキシダーゼ反応産物は蛍光退色しないため、長波長UVランプなどにより簡単に反応の確認（強い青色蛍光が得られます）も行えます。もちろんこの操作により反応が影響を受けることはありません。

QuantaBlu^TM は短時間で低濃度のパーオキシダーゼを迅速に検出できる化学蛍光基質で、フラットなベースラインによる、高いシグナルノイズ比の検出が特徴です。下のグラフはウェルあたり0-10mgのパーオキシダーゼを1.5-6.5分間の反応時間で検出した結果を示しています。1サイクル (1.5 分間の反応) では 2.5 pg のパーオキシダーゼが検出可能ですが、6サイクル (6.5 分間の反応) では0.625 pg まで感度が増幅されています。

特徴 TMB, OPD or ABTS 基質よりも高感度エンドポイント、カイネティックアッセイが可能インキュベーションは室温または37℃で1.5～90分間広いダイナミックレンジ (パーオキシダーゼ濃度域で4 log) 反応液は24時間安定（HRP添加前）最大励起/蛍光； 325/420、励起/蛍光域； 315-345/370-460 蛍光退色しない安定な青色蛍光産物
		図1. QuantaBlu と他の基質との比較 QuantaBlu^TM基質と各発色基質を室温で30分間反応させ、反応停止液を添加した。QuantaBlu^TM基質で最も高いシグナルノイズ比と最も低い検出限界を得た。
		図2. QuantaBlu^TM 基質による検出の迅速性と感度 0-10 pg/wellで結合させたビオチン標識パーオキシダーゼの検出を QuantaBlu^TM により行った。QuantaBlu^TM は読み取り間隔が1分間のカイネティックモードで検出した。

References

Savage, M.D., Johnson, S.E., Fujimoto, E.K., Lipton, W.E. and Horneij, I. (1998). QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate: the ideal peroxidase substrate. Previews 2(1), 6-9.
Savage, M.D, King-Spengler, T. and Johnson, S.E. (1998). QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate offers rapid data acquisition and high sensitivity. Previews 2(2), 18-19.
Ayala, P., et al. (2002). Infect. Immun. 70, 5965-5971.
Atamna, H., et al. (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 686-691.
Jefcoat, A.M., et al. (2001). Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, L704-712