[ピアス]サーモフィチEャーサイエンチEフィチE Pierce Native IgG Detection Reagent and Kit

Thermo　Scientific Clean-IP Western HRP Kit and conjugate

免疫沈降後のウエスタンブロットで目的蛋白質がマスクされていませんか？

Pierce Native IgG Detection Reagentを使用することで免疫沈降後のウエスタンブロットでIgG由来の重鎖・軽鎖による阻害(マスク)を受けない鮮明で特異的な検出(図1)が可能になります。多くの酵素標識2次抗体は種特異的な抗体(anti-mouse, anti-rabbit等)であり、免疫沈降の際レジンから変性・溶出した捕獲抗体(変性IgG)とウエスタンで使用する1次抗体(未変性IgG)が同種の場合、それらを酵素標識2次抗体は同様に認識してしまいます。。Pierce Native IgG Detection Reagentは未変性のIgGとだけ結合するため、酵素標識2次抗体から置き換えるだけで、鮮明なイメージが得られます。またIgGを内在的に含むような組織抽出物(肝組織や脾臓組織ホモジネートなど)のウエスタンブロットにも有効(図2)です。Pierce Native IgG Detection Reagentは抗体ホストによらず広範囲の1次抗体に対応(注)、またプロテインAアガロースやプロテインGアガロースからの免疫沈降物に対応します(図3)注)1次抗体がMouse IgG1の場合、使用できません

特徴

抗体ホストによらず未変性(native)なIgGを認識
プロテインAアガロース・プロテインGアガロース・抗IgGアガロースを使用した免疫沈降物はブロッキングバッファーによらず対応 (Milk, BSA, SuperBlock Blocking Buffer, StartingBlock Blocking Buffer等)
免疫沈降でのIgG共有結合や抗体ホストによるキットの使い分けも不要。化学発光検出ではメンブランからの抗体剥離と再プローブも可能
HRP用の化学発光基質・化学蛍光基質・発色基質に対応
大幅なプロトコル変更も不要。HRP標識2次抗体から置き換えるだけ
変性IgG由来の重鎖・軽鎖バンドによる阻害(マスク)を受けなぁE明変性IgG由来の重鎖・軽鎖バンドによる阻害(マスク)を受けない鮮明なイメージ

Western blot detection specificity using the Pierce Native IgG Detection Reagent

図1: A431細胞抽出物のマウス抗体による免疫沈降とウエスタンブロット
レーン1-5はPierce Native IgG Detection Reagent (HRP)、レーン6はgoat anti-mouse HRPでプローブした。レーン1: p53を発現させたA431細胞抽出物 (陽性コントロール), レーン2 および 3: 細胞ライセート未添加(陰性コントロール)の免疫沈降カラムの洗浄画分(L2)と溶出画分(L3), レーン4-6: 完全な免疫沈降の洗浄画分(L4)と溶出画分(L5, L6)

免疫沈降条件: p53を発現させたA431細胞の総ライセート(500 ug)にAnti-p53抗体 (2 µg)を添加、4℃にてオーバーナイトの震盪攪拌を行った。Protein A Agarose Resin (# 20333)を結合/洗浄バッファー (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP40, 5% glycerol; pH 7.5)で3回洗浄して、50% スラリーゲル (100 µl)を各チューブに添加、4℃で1時間の攪拌インキュベーションを行った後、未結合の蛋白質は遠心(1,000 x g, 1 min.)で回収、レジン-抗体-蛋白質の複合体を500 ul結合/洗浄バッファーにて3回洗浄した。p53蛋白質：抗体複合体はプロテインAレジンを30 ulの5X Lane Marker Reducing Sample Buffer (#39000)に懸濁、5分間ボイルした。
ウエスタンブロット条件: Tris-glycineゲルで分離した蛋白質をPVDF膜 (#88158)に転写した。転写後の膜を 1% milk in TBST でブロック、一次抗体Mouse anti-p53 primary antibody (BD Biosciences, 1 µg/ml)に続き、Pierce Native IgG Detection Reagent (HRP) (0.1 µg/ml)またはGoat Anti-Mouse HRP (#31430, 0.16 µg/ml)でプローブした。検出は化学発光基質SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (#34080)で行った。

Western blot detection using the Pierce Native IgG Detection Reagent

図 2: マウス肝組織抽出物のウエスタンブロット マウス肝組織からの全蛋白質抽出物 (50 µg)をBio-Rad Criterion gelにより分離、PVDF膜に転写した後、1% milk in TBSTによりブロックした。ブロック後の転写膜はmouse monoclonal anti-Cdk1 (LabVision) (0.2 µg/ml)とgoat anti-mouse HRP (0.16 µg/ml)またはPierce Native IgG Detection Reagent (HRP) (0.2 µg/ml)によりプローブした。

Reveal target protein using Pierce Native IgG Detection Reagent

図 3: 549細胞ライセートのラビット抗体による免疫沈降とウエスタンブロット
Protein A/G アガロースとrabbit anti-NFkB (パネル A, B)またはrabbit anti-Bax (パネル C, D)を使用してA549細胞ライセートからのNFkBとBaxの免疫沈降を行った。goat anti-mouse HRPで検出したパネルAとCでは目的蛋白質はマスクされているが、Pierce Native IgG Detection Reagent (HRP)で検出したパネルBとDでは目的蛋白質が出現している

免疫沈降条件: NFkBとBaxを発現しているA549細胞ライセート4検体に対して4 ug の rabbit anti-NFkB (Upstate) または rabbit anti-Bax (Upstate) を添加、4℃でオーバーナイトの震盪攪拌を行った。Protein A/G Agarose (#20421)めBinding/Wash buffer (#28376)で3回洗浄した後、Binding/Wash buffer で調整した50% スラリーゲル 100 ulをマイクロチューブに添加、室温にて2時間の震盪攪拌を行った。未結合の蛋白質は遠心(2,500 x g, 1 min.)により回収した。レジン-抗体-蛋白質の複合体は500 ul Binding/Wash bufferで3回洗浄、Bax-抗体またはNFkB-抗体の複合体はProtein A/G Agaroseを150 µl の 5X Lane Marker Reducing Sample Buffer (#39000)に懸濁後、5分間ボイルして溶出させた。

ウエスタンブロット条件: Tris-HEPES Precise Protein Gels (#25244)により蛋白質を分離、PVDF (#88158)膜に転写した。転写後の膜をStartingBlock T20 Blocking Buffer (#37543)でブロックして、rabbit anti-NFkB または rabbit anti-Bax を1次抗体(1 ug/ml, Upstate)としてプローブした。続いて0.4 µg/ml Pierce Native IgG Detection Reagent (HRP) (パネル B, D) または0.16 ug/ml Goat Anti-Rabbit HRP (#31460) (パネル A, C)でプローブした。NFkBとBaxは化学発光基質Pierce ECL Chemiluminescent Substrate (#32106)で検出した。

化学発光基質 (HRP)	Clean-Blot IP Detection Reagent(Pierce) 推奨希釈率
SuperSignal West Femto	1:200 EE1:4,000 (1:4,000EE2.5 ul試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)
SuperSignal West Dura	1:200 EE1:2,000 (1:2,000EE5 ul試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)
SuperSignal West Pico	1:40 EE1:1,000 (1:1,000EE10 u試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)
Pierce ECL	1:40 EE1:400 (1:400EE25 ul試薬を10mlのブロッキングバッファーに添加)