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糖タンパク質は多くの生物学的プロセスに関与しています。サーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランドの2つのキットは血清・組織/細胞ライセートを含むタンパク質ミクスチャーから糖タンパク質を単離することを目的とした、Concanavalin
A (ConA) と Wheat Germ Agglutinin (WGA) を利用したレクチンベースのキットです。レクチンは糖鎖に対して選択的な親和性を有するタンパク質で、その結合特異性により分類されています。ConA
レクチンはα結合型マンノースと末端グルコース基、WGAレクチンはNアセチルグルコサミン(GlcNAc)およびシアル酸に選択的に結合します。これら2つのキットを用いて血清や細胞ライセートから糖タンパク質を単離し、他社から市販されている糖タンパク単離キットやレクチンレジンと溶出フラクションの純度や回収率の比較を行いました。 |
細胞ライセートの調製:
培養細胞 (CHO) をT75フラスコで95％まで集密培養した。細胞の2回のTBS洗浄後、スクレイパーにより回収し50
mlコニカルチューブに移した。1,000 x gでの遠心分離を5分間行い、20
ulの Halt Protease Inhibitor (#78415)を含む2
mlのM-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent (#78501) により細胞を可溶化した。ConAキットでの単離には
600 ul 細胞ライセート(840 ug)を150 ul の
5x結合/洗浄バッファーで希釈、WGAキットでの単離は320
ul 細胞ライセート(960 ug)を80 ul の5x結合/洗浄バッファーで希釈した。
ヒト血清:
約320 ul(1.5 mg)ヒト血清(#31876)を80 ulの5x結合/洗浄バッファーで希釈、両キットに用いた。\
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糖タンパク単離 (図 1)：
糖タンパク試料を、100 ulのConAレジンまたはWGAレジンを含むスピンカラムに添加、室温にて10分間の転倒攪拌を行った。遠心分離後、レジンを400
ulの1x結合/洗浄バッファーにより4回洗浄した。200
ul溶出バッファーをレジンに添加、ConAレジンでは5分間、WGAレジンでは10分間の室温での転倒攪拌を行い、結合した糖タンパク質を溶出させた。この溶出操作は繰り返し行い、得られた溶出物をひとつに合わせた。レクチンを含む、残っているタンパク質の全ては200
ulのSDS-PAGEサンプルバッファーを添加し95℃で5分間加熱することによりレジンから除去した。他社製品により処理された試料は各製造元のプロトコルに沿って調製された。他社レクチンレジンにより処理された試料は、製造元からの推奨バッファーを使用してサーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランドプロトコルに従い、行った。 |
電気泳動およびゲル銀染色：
糖タンパク画分は全て容量を均一化、5xSDSサンプルバッファーにより4:1に希釈、95℃にて5分間加熱した後、8-16%
SDS-ポリアクリルアミドゲルにより分離、SilverSNAPTM Silver Stain II (#24612)により銀染色に供した。
結果：
CHO細胞ライセートおよびヒト血清試料中の糖タンパク質を
ConA (図2A, 2B) および WGA (図3A,
3B) Glycoprotein
Isolation Kitsで単離した。糖タンパク質の回収率は7-9%
(血清)、4-5% (CHO細胞ライセート)となった。サーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランド
Glycoprotein Isolation Kit, WGA
は市販されているWGAレジン(他社A製品：
図4A, 4B)および競合キット(他社Qキット：
図4B)と比べて、細胞ライセートおよび血清からのより多くのタンパク質を単離した。サーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランド
Glycoprotein Isolation Kit, ConA
は他の市販ConAレジンやConA糖タンパク単離キットよりも頑強であり、他社ConAレジン(競合A社)や他社キット(競合G社)
(図5A, 5B)のようなConAレクチン固定化アガロースからのリークは見られなかった。さらにサーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランドConAキットでは明らかに多くの糖タンパク質を細胞ライセートから単離した(図5A)。 |
図 2. ConAによる糖タンパク質の単離 |
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図 3. WGAによる糖タンパク質の単離 |
約840 ugのCHO細胞ライセートと1.5 mgのヒト血清試料を100
ulのConAレジンに添加、プロトコルに従い操作を行った。単離した糖タンパク質は
8-16% SDSポリアクリルアミドゲルにより分離、銀染色に供した。
2A. CHO細胞から溶出した糖タンパク画分 2B. ヒト血清試料から溶出した糖タンパク画分
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約960 ugのCHO細胞ライセートと1.5 mgのヒト血清試料を100
ulのWGAレジンに添加、プロトコルに従い操作を行った。単離した糖タンパク質は
8-16% SDSポリアクリルアミドゲルにより分離、銀染色に供した。
3A. CHO細胞から溶出した糖タンパク画分 3B. ヒト血清試料から溶出した糖タンパク画分
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図 4. ヒト血清および細胞ライセートからのサーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランドWGAレジンと他社製品との回収率の比較
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図 5. サーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランドConAレジンと他社CinAレジンまたはキットとのConAレジンの浸出性試験 |
CHOライセートおよびヒト血清試料をサーモフィッシャーサイエンティフィック ピアスブランド
Glycoprotein Isolation Kit, WGA
と他社製品（レジンのみ、キット内容物）で処理した。均等量の総タンパク試料を各レジンに添加、溶出した糖タンパク質をそれぞれ均等量で8-16%
ポリアクリルアミドゲルで分離した。
4A. CHO ライセートから溶出した糖タンパク質画分
4B. ヒト血清から溶出した糖タンパク質画分図中凡例:
(E) 溶出画分、 (R) レジンからのサンプルバッファーボイル抽出画分
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CHOライセートとヒト血清試料を
Glycoprotein
Isolation Kit, ConA と他社ConA製品で処理、均等量の総タンパク試料を各レジンに添加した。溶出させた糖タンパク画分は、レクチンを浸出させるためにSDS-PAGEサンプルバッファーボイルしたConAレジンからの抽出画分と比較した。全ての画分を均等量で8-16%
ポリアクリルアミドゲルにより分離、ゲルの銀染色を行った。
5A. CHOライゼートから溶出した糖タンパク画分
5B. ヒト血清から溶出した糖タンパク画分
矢印は、溶出操作により浸出したレクチン由来のタンパク質バンドを示す。
図中凡例: (E) 溶出画分、 (R) レジンからのサンプルバッファーボイル抽出画
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 ：取扱説明書  ：MSDS(英語版) |
| Cat # |
製 品 名 |
Pkg. Size |
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| 89804 |
Glycoprotein Isolation Kit, ConA
ConAと強いアフィニティーのある糖タンパク10サンプル分
(最大640μl、タンパク質全量1-1.5mgとする) |
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ConA Lectin Resin,
1.1 ml settled resin supplied
as a 50% slurry containing a hapten buffer |
1.1 ml |
| 結合/洗浄バッファー, 5X Stock Solution |
6.5 ml |
| 溶出バッファー |
5 ml |
カラムアクセサリーパック
(ボトムキャップ付スピンカラム10
,コレクションチューブ20) |
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Kit |
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| 89805 |
Glycoprotein Isolation Kit, WGA
ConAと強いアフィニティーのある糖タンパク10サンプル分
(最大640μl、タンパク質全量1-1.5mgとする) |
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WGA Lectin Resin,
1.1 ml settled resin supplied
as a 50% slurry containing a hapten buffer |
1.1 ml |
| 結合/洗浄バッファー, 5X Stock Solution |
6.5 ml |
| 溶出バッファー |
5 ml |
カラムアクセサリーパック
(ボトムキャップ付スピンカラム10 ,コレクションチューブ20) |
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Kit |
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