StartingBlockTM ピアスはウェスタンブロッティングやELISAで最初に研究者を悩ます「どのブロッキングバッファーが最適なのか？」という問題に、ひとつの答えを出しました。それがStartingBlockTM Blocking Buffer です。StartingBlockTM は化学発光検出系や発色検出系でのバックグラウンドを最小限に抑えるためにデザインされています。StartingBlockTMは、血清タンパク質を含まず、またミルクによるアビジンビオチン系での阻害や、他のブロッキングバッファーでは見られるウサギ抗体との交叉反応もありません。 特徴 検出法、抗体ホスト (goats, rabbit, mouse等)、標識酵素に関わらずウェスタンブロットやELISAなどの幅広い検出系で使用が可能 ボトルから直接メンブランやELISAに添加可能なReady-To-Useな組成 ブロッキング時間はウェスタンブロットで 1-15 分間、ELISAでは数秒間 ELISAのブロッキングではインキュベーションが不要であり、自動分注・アスピレーションを利用したハイスループットなプラットホームでの高速化が可能 Restore Stripping Buffer (#21059)で抗体剥離を行う場合、StartingBlockTM でブロックされたメンブランは剥離後の再ブロックが不要 シグナル：ノイズ比 10:1 - 20:1 を実現 迅速で堅実なブロック 図 1A 1B 1C 1D 転写膜の種類 Nitrocellulose PVDF Nitrocellulose PVDF フィルムへの現像時間 30 minutes 30 minutes 16 hours 16 hours 図 1　A-D. StartingBlock Blocking Buffer での比較：ニトロセルロース膜とPVDF膜を使用したブロット上でのトランスフェリン受容体（CD71）へのプローブ 粗精製した CD71 を系列希釈した後 4-12 % Bis-Tris, 10-well gelによる電気泳動で分離した。 電気泳動後のタンパク質はニトロセルロース膜 (#77012) および PVDF膜(#88114) に転写した。各メンブランは StartingBlock (TBS) Blocking Buffer で 15 分間ブロックした。メンブランは 250 ng/ml anti-CD71 monoclonal (BD Pharmingen) と 2.0 ng/ml Goat anti-Mouse-HRP (#31432) によりプローブされた。1次抗体および2次抗体は 0.05% Surfact-Amps 20 (Tween-20) (#28320) を含むStartingBlock (TBS) Blocking Buffer で各濃度まで希釈、メンブランに添加してそれぞれ1時間および30分間のインキュベーションを行った。検出は SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate (#34075)により行った。 各レーンへの粗精製 CD71 添加量: L1: 27.2 μg, L2: 13.6 μg, L3: 6.8 μg, L4: 3.4 μg, L5: 1.7 μg StartingBlock TBS Blocking Buffer によりブロックされたニトロセルロース膜とPVDF膜でのトランスフェリン受容体（CD71）の検出では、ニトロセルロース膜での感度が優れた。 フィルムへの現像（30分間および数時間）では、ニトロセルロース膜およびPVDF膜の両方で、バックグランドの低い結果が得られた。 注: 図1の全てのメンブランは（この後） Restore Western Blot Stripping Buffer (#21059) と 37℃で30 分インキュベーションして、抗体を剥離した。 図 1A 1B 1C 1D 転写膜の種類 Nitrocellulose PVDF Nitrocellulose PVDF フィルムへの現像時間 30 minutes 30 minutes 24 hours* 24 hours* *　SuperSignal® West Dura Chemiluminescent Substrate での最長発光時間 図2 A-D. StartingBlockでブロックしたブロットの抗体剥離(ストリップ)後の比較：ニトロセルロース膜とPVDF膜でのトランスフェリン受容体（CD71）検出 メンブランを 500 ng/ml (図1の2倍の濃度) anti-CD71 monoclonal (BD Pharmingen) および 2.0 ng/ml Goat anti-Mouse-HRP (#31432) で再プローブした。1次抗体および2次抗体は 0.05% Surfact-Amps 20 (Tween-20) (#28320) を含む StartingBlock (TBS) Blocking Buffer で希釈、メンブランに添加して、それぞれ1時間および30分間のインキュベーションを行った。SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate (#34075) により検出した。再プローブの前にメンブランの再ブロッキングは行っていない。 各レーンの粗精製 CD71 量: L1: 27.2 μg, L2: 13.6 μg, L3: 6.8 μg, L4: 3.4 μg, L5: 1.7 μg 検出感度はニトロセルロース膜での検出が優れ、PVDF膜での検出感度も向上した。フィルムへの現像では、両メンブランにおける30分間と数時間の感光で非常に低いバックグラウンドの結果が得られた。 図 3. EH2MIP1A によるサンドイッチELISA法での検出 Anti-Human MIP-1α抗体を96穴ポリスチレンプレートにオーバーナイトで吸着させた。Starting Block (PBS) Blocking Buffer を各ウェルに添加後、速やかに除去した。既知濃度の組替型ヒトMIP-1αから希釈・調製した試料をブロッキング済みのマイクロプレートの各ウェルに添加した。インキュベーションと洗浄の後、Anti-Human MIP-1α抗体ビオチン標識を添加、インキュベーションと洗浄を行った。Streptavidin-HRPの添加後、HRP酵素検出用の発色基質TMBにより MIP-1αを検出した。この系での結果の再現性を示すために同処理と同試料により検出は2回行われた。ブランク値を各測定値から引き、平均シグナル：ノイズ比は33となった。 Reference 1. Lorenzon, N.M., et al. (2004). J. Biol. Chem. 279, 44057-44064. Cat.# 製　品　名 容量 37538 StartingBlock (PBS) Blocking Buffer 1 L 37539 StartingBlock T20 (PBS) Blocking Buffer <<0.05% Tween®-20含有>> 1 L 37542 StartingBlock (TBS) Blocking Buffer 1 L 37543 StartingBlock T20 (TBS) Blocking Buffer <<0.05% Tween®-20含有>> 1 L 製品情報は掲載時点のものですので、ご覧いただくタイミングにより製品情報が変更されている場合があります。 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com