[ピアス]サーモフィッシャーサイエンティフィックビオチン標識率測定試薬

ビオチンによる抗体や生体分子の標識は広く行われていますが、この標識効率を推測する手段としては様々な制限を受ける HABA置換法以外に実際的な方法が殆ど無いため、多くの研究者は色々と不便な思いをしてきました。長いプロトコル、面倒な計算、さらに標識した貴重な試料の一部を無駄にしなければならない事などが長年研究者を悩ませてきました。サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドの新製品EZ-Link NHS-Chromogenic Biotin によりビオチン標識率を正確に決定することができます。

HABA 置換法（HABA:AVIDIN法）
ビオチン標識率を推測することで、アビジン：ビオチン系のアッセイの最適化やビオチン標識反応の再現性を確保することが出来ます。2-(4'-hydroxyazobenzene)-2-carboxylic acid (HABA) はアビジンに弱い結合を示し、アビジン：HABA複合体は500nmの波長に対する吸収を示します。
HABA置換法はHABA：アビジン複合体のHABAがビオチン標識分子のビオチンに置換されることにより示す500nmでの吸光度の減少を利用します。タンパク分子あたりに標識されたビオチンのモル数をここから推測することが出来ます。

図 1. NHS-Chromogenic Biotin 構造

標識後のタンパクの疎水的凝集を低減させ、またアビジン等のビオチン結合性タンパクとのアフィニティを利用したアッセイにおける立体障害(結合阻害)を軽減する、親水性 polyethylene glycol (PEG3) による長いスペーサー
水溶液中でリシンεアミンやN末端αアミンに対して高い反応性を示すNHS(N-hydroxysuccinimide)エステル活性反応基
タンパクに共有結合して 354 nm での強い吸収を示すbis-aryl hydrazone chromophore

表 1. NHS-Chromogenic Biotin 特性
組成	C₃₈H₅₀N₈O₁₀S
分子量	810.93
スペーサーアーム長	41 Å
吸光係数	29,000 @ 354 nm
標識後の付加分子量	695.83
保存条件	4℃での乾燥条件
保存条件	Aromatic NHS ester（pH 7-9 で1級アミンと反応）

図 2. human IgG の EZ-Link NHS-Chromogenic Biotin による標識
1 mg/ml ヒト IgG PBS溶液 1 ml を　EZ-Link NHS-Chromogenic Biotin で修飾した。試料は二点で調整し、標識後に 5 ml Zeba Desalt Spin Columns で過剰の試薬の除去を行った。共有結合的に付加された chromogenic biotinylation 試薬による354 nmでの吸光度の上昇と 280 nmでの吸収によるタンパクの損失が小さい(脱塩カラムでの回収率が高い)事が判る。

＊ビオチンも250 nmに弱い吸収を持つ（A250 = 0.111 for 1 mg of biotin/ml）

特徴

ビオチン標識と標識率の決定をひとつの試薬で行うことが可能

表 2. HABA置換法とEZ-Link NHS-Chromogenic Biotin でのビオチン標識率の推定
	HABA:Avidin Method (mol/mole Human IgG)	NHS-Chromogenic Biotin (mol/mole Human IgG)
1 mg/ml Human IgG (1 ml)	1.11	1.86
1 mg/ml Human IgG (1 ml)	1.41	2.03

全試料でプロナーゼ消化は行われていない
表2では1 mg/ml IgG 試料を複製、同一条件での反応が行われています。HABA置換法では(プロナーゼ消化を行っていない)IgG分子上ビオチンとアビジンの結合が立体障害により阻害されNHS-Chromogenic Biotinによる測定値よりも低い値が推定されています。一方、NHS-Chromogenic Biotinでは直接吸光度が測定されビオチン標識度が推定されるので、実際の値に近い値が算出されていることが予想されます。

ただし、標識後の検出や精製において実際にアビジンが結合できるビオチン数は、立体障害を受けるHABA置換法により推定される値が近いことになります。サーモフィッシャーサイエンティフィック　ピアスブランドでは様々なタンパク濃度・ビオチン試薬量について実験を行い、HABA置換法ではNHS-Chromogenic Biotin法での0.65-0.85となり、脱塩処理などが適当であれば充分な再現性が得られることも確認しています（データ未公開）。

　：取扱説明書　　

　：MSDS(英語版)

Cat #	製　　品　　名	Pkg.Size
21325	EZ-Link NHS-Chromogenic-Biotin	Kit

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