[ピアス]サーモフィッシャーサイエンティフィック DNA 3’末端ビオチン標識キット

末端付加酵素（TdT）によるDNA 3' 末端 (3’-OH末端) へのBiotin-N4-CTPの導入キットです。TdTは一本鎖DNAへの選択性がありますが、二本鎖DNA(突出末端や平滑末端)でも可能です。
ただし、収率は低くなります。

特徴

非放射性標識（暴露や廃棄の問題もありません）
1-3分子のビオチン標識リボヌクレオチドがDNAの3’-OH 末端に導入
ハイブリダイゼーションや配列特異的なタンパク質結合を阻害しにくい
30分の標識反応、標識プローブは1年以上安定
LightShift^® Chemiluminescent EMSA Kit (#20148) によるゲルシフトアッセイに対応

標識効率のシーケンスゲル解析
Biotin 3´ End DNA Labeling Kitにより、異なる10のオリゴ (サイズ： 21-25 塩基) 取扱説明書に従いビオチン標識した。続いて、TdT反応の生成物をT4ポリヌクレオチドキナーゼ (PNK) と[γ-³²P]ATPにより放射性ラベルし、20%アクリルアミド/8Mウレア/TBEシーケンスゲルで2-3時間泳動し、X線フィルムにオーバーナイトで感光させた。記号nは開始オリゴ (ビオチン未修飾) の位置を表し、TdTによる biotin-N4-CTP の導入は1つ (記号n+1) または2つ (記号n+2) に留まった。ゲルのバンドは切り出され、液体シンチレーションカウンターにより定量された。ラベル効率は72% (EBNAセンス配列) から94% (Oct-1センス配列) となった。キットに含まれるコントロールオリゴは88-94%の効率でラベルされた。

LightShift EMSA Kit using 3´ biotin-labeled duplexes.
センスおよびアンチセンス配列をBiotin 3' End DNA Labeling Kitにより標識し、室温で4時間ハイブリダイズさせ、転写因子に対する結合領域を含む二本鎖を形成させた。ゲルシフトアッセイはLightShift Chemiluminescent EMSA Kitを使用し、取扱説明書に従い結合反応には20 fmolの二本鎖を用いた。転写因子はNE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (#78833)を使用して調製したHela細胞核抽出物(反応あたり 2 μl or 6-7 μg のタンパク質)に由来し、NF-ｋBの場合、核抽出物はTNF-αで誘導したHela細胞または未処理の細胞を用いた。ENBA-1はキットに含まれる過剰発現させたEBNA-1因子を含む抽出物を使用した。200倍モル過剰の未標識二本鎖DNAを含む競合反応はDNA-protein相互作用の特異性を示すために行われた。結合反応は6%アクリルアミドゲルで行い、陽電荷ナイロンメンブランに30分の転写を行い、検出はLightShift EMSA Kitの試薬で行った。ブロットはX線フィルムに1分間感光させた。