タンパク質間相互作用（Protein : Protein Interaction, PPI）の検出は2ハイブリッド法、共免疫沈降法やプルダウン法または架橋化などにより行うことができます。2ハイブリッドは酵母などの細胞核内で行い、PPIを確認する重要な手法として確立されていますが、2ハイブリッド法ベースの製品は残念ながらピアス社にはございません。細胞外での検出は、細胞内での局在化(濃度)の問題や立体構造の維持の問題もありますが、こちらも広く利用されている手法です。餌タンパク質(bait)と呼ばれる相互作用に関与していると思われる既知タンパク質と、餌タンパク質と相互作用のある獲物タンパク質(prey)のアフィニテイをいかに生理的条件に近づけて、最適化し検出するかが重要になります。 共沈降法(Co-IP) 従来の免疫沈降法を改変した共沈降法はPPI複合体を特異抗体とビーズで沈降させる手法です。細胞ライセートを破砕（可溶化）して行うため、実際の細胞内での局在条件とは異なります。細胞破砕では熱変性、可溶化では界面活性剤による立体構造の変化も考えられます。2価金属イオンの添加などの最適化も必要になります。また通常の免疫沈降に比べて洗浄数を減らしたり、組成をマイルドにしたりもします。餌タンパク質に対する特異抗体がない場合にはHA-Tag、c-Myc、FLAGなどのTag抗体を使用します。また不活性化したコントロールゲルによる比較なども非特異的な吸着を調べるために行われます。 プルダウン法 プルダウン法は抗体を使用せず、GSTやpoly-HisなどのTagを融合させたbaitタンパク質を発現させて、ビーズに固定して使用します。親水性の高いTagを使用することで発現タンパク質の水溶性も維持することもできるため、大量発現させたbaitタンパク質のネイティブな条件での精製も可能になります。精製されたbaitタンパク質にビオチン標識することでもプルダウンカラムの作製は行うことができます。一般的に使用されるTagや標識は立体障害が少ないと思われる低分子が選択されます。 ファーウェスタン法 PAGEゲル内やブロット上で、特異抗体の代わりに餌タンパク質をプローブとして使用します。還元剤や変性剤による立体構造の変化を防ぐために、ネイティブPAGEで行われることも多いようです。細胞ライセートを泳動し餌タンパク質で検出したり、共沈降やプルダウンした獲物タンパク質の確認にも使用されます。 クロスリンカー法 細胞内での架橋であれば疎水性クロスリンカー、細胞表面上やライセート中であれば水溶性クロスリンカーが使用されます。クロスリンカーの選択は官能基、PPI分子間の距離、反応pH、収率などが影響してきます。例えば反応収率が高いクロスリンカーは非特異的な架橋産物が多く、低収率のクロスリンカーは一般的にアフィニティの高い分子間の架橋産物が得られる傾向があるようです。また、ライセートのような溶液中での架橋は、細胞内で局在している実際のタンパク質濃度とは異なるため、細胞内で会合しない分子も釣られる場合も多いようです。精製baitのアミンに収率の低いフォトプローブを含むクロスリンカーを結合させたあと、(過剰な試薬の除去と適当な希釈を行い)ライセートに添加しUV照射による架橋を行う手法もよく行われます。いずれの手法にしても、PPIが生じる条件を予想してアッセイ系を最適化させる事、得られた結果のアッセイ間の検証が重要になります。最適pH、イオン強度、共存因子などの他に、界面活性剤や変性・還元剤の共存可能濃度や試薬に使用されている添加剤(プロテアーゼインヒビターに含まれるEDTA等)についてもチェックする必要があります。 M-PER lysis buffer について 哺乳動物細胞用の可溶化バッファーM-PERが予め含まれているキットもあります。マイルドな非イオン性界面活性剤カクテルの25mMビシンバッファー(pH7.6)で構成されています。ライセートは直接IP可能ですが、個々のタンパク質の活性やPPIについては確認していません。またM-PERの組成は公表されておりませんので御注意願います。その他の塩、酵素インヒビター、アミン化合物は含まれていません。 ProFound タンパク質相互作用 (PPI) 検出シリーズ ● Pull-Down Assay Kits ● Far-Western PPI Kits ● ProFound Co-IP Kits ● Sulfo-SBED PPI Label Transfer Kit ● Mapping Kit 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com