| PIERCE社のタンパク質抽出試薬としてはバクテリア用、酵母用、哺乳動物用、組織細胞用、核タンパク質用、膜タンパク質用、TAG付きタンパク質用などがあります。また最近、ミトコンドリア分画用試薬も発売されました。これらの製品の多くは１液で構成されており(分画用製品を除く)、簡単で迅速しかもマイルドな条件でタンパク質を抽出できるのが特徴です。 #78243 B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent, 165ml #78248 B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent, 500ml #78266 B-PER Reagent in PBS, 500ml #78260 B-PER II Reagent, 250ml #78503 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent, 25ml #78501 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent, 250ml #78510 T-PER Tissue Protein Extarction Reagent #89826 Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Kit #78833 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Kit #89874 Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells #78410 Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit, EDTA-Free #36978 PMSF Q1) B-PERでのタンパク質の回収率が悪いのですが？ Q2) B-PERで抽出したタンパク質活性は維持される？ Q3) 抽出に続く、タンパク定量・ウェスタン・Tagアフィニティ精製は？ Q4) BCA・Coomassieアッセイでの各ライセートの使用は？ Q5) M-PERで実績のある培養細胞株は？ Q1) B-PERでのタンパク質の回収率が悪いのですが？ A1) E.Coliではプロモーターによっては４0wt％程度まで組み替えタンパク質を発現させることが出来ますが、多くの場合は封入体として不溶化するようです。B-PERは主成分は非イオン性界面活性剤であり、封入体の変性・可溶化は出来ません。#78155 Inclusion Body Solubilization Reagentで可溶化して下さい。また封入体を可溶化する場合、変性前にリゾチーム等で細胞残渣をまず消化し封入体を精製する事をお薦めします。またB-PERにはプロテアーゼインヒビターは含まれていません。抽出後の内在性プロテアーゼによるタンパク質の分解を抑えるにはプロテアーゼインヒビターを添加することをお薦めします。グラム陽性菌や高グルコース培地で培養された菌では、抽出効率が悪い場合もあります。ソニケーショーンや凍結融解を併用するか、培地成分を変更すると改善される場合もあります。またタンパク質の活性を維持するためにNaCl等を添加する場合、B-PERに添加可能な塩濃度は0.5Mまでにして下さい。 Q2) B-PERで抽出したタンパク質活性は維持される？ これはタンパク質に依存します。ただ、B-PERの成分は非イオン界面活性剤で抽出された多くのタンパク質はネイティブな構造を維持できるようです。また、試料中の夾雑物に関しては抽出後に希釈または透析する事もできます。もちろん、B-PERは透析可能です。 Q3) 抽出に続く、タンパク定量・ウェスタン・Tagアフィニティ精製は？ 可能です。BCA 法では希釈せずにそのまま、Micro BCA 法では純水で1：10、Coomassie (Commassie Plus) 法では純水で1：2に希釈して定量して下さい。またウェスタンブロットや6×His・GST等のTag付きタンパク質のアフィニティ精製も阻害しません。他社のアフィニティ精製カラムを使用する場合、試料に対し1：1以上の結合バッファーで調製する事をお薦めします。ピアス社でも、便利なB-PER 6×His 用の精製キット(#78300 Spin-Column Kit, #78100 Pre-Pack Columns Kit)やGST 用の(#78400 Spin-Columns Kit, #78200 Pre-PackColumns Kit)を発売しております。B-PERで抽出した試料の粘度が高い場合、DNA混入が考えられます。通常、DNAは抽出の際にペレットとして分離されますが、大量のDNAが存在した場合、水溶性画分に混入することがあります。DNaseを添加することで殆どの場合、粘度による問題は解消されます。 Q4) BCA・Coomassieアッセイでの各ライセートの使用は？ 各製品の50％aq, 25％aq, 0% (コントロール)で調製したBSA標準溶液(濃度：0-1000ug/ml)のBCA検量線では、Mem-PER以外は殆ど影響なくコントロールとの非常に高い一致が見られました。Mem-PER試薬の除去は、Slide-A-Lyzerなどの透析カセットで行えますが、膜タンパク質を可溶性を維持するため0.5％程の界面活性剤を添加した透析バッファーで行って下さい。界面活性剤の影響を受け易いCommassie法では、50% M-PER, 50%T-PERのみで検量線でコントロールとの一致が見られました。 Q5) M-PERで実績のある培養細胞株は？
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