培養哺乳動物細胞から40分でミトコンドリアを分画するキットです。多検体の調製に適した試薬ベース（非機械的）のプロトコルと、従来のダウンスホモジナイザーを併用するプロトコルから選択できます。 ● 約40分間、ベンチトップのプロトコル（分画遠心分離は12000×g） ● ミトコンドリはインタクトな状態で分画 ● すぐ使用できる Ready-To-Use な試薬、50回分 #89874 Pierce Mitochondoria Isolation Kit Q1）細胞の回収法は？ Q2) Cell-Lineと回収率 Q3) プロテアーゼインヒビターの添加 Q4) Low-SpeedとHigh-Speed Q5) ミトコンドリアの活性 Q1）細胞の回収法は？ A1) 培養細胞であればトリプシン処理かスクレイパーにより回収できます。細胞は充分に洗浄されるため、トリプシンの持込はありません。ただし、組織からのミトコンドリア分画には対応していません。 Q2) Cell-Lineと回収率 A2) 残念ながら各細胞における回収率に関するデータはピアス社でも調査していないようです。C6細胞やNIH3T3などの典型的なCell-Lineでの平均的な回収率としてはReagent-Baseプロトコルでは下記のA4)を御参照下さい。Dounceプロトコルではストローク数に依存します Q3) プロテアーゼインヒビターの添加 A3) Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Freeを使用する場合は#89874の 試薬Aと試薬Cに終濃度10ul/mlで添加して使用して下さい。 Q4) Low-SpeedとHigh-Speed A4) 通常のHigh-Speedプロトコル（Step 7での12,000 x g, 15min.回収）ではリソソームやペルオキソームもスピンダウンされます。ペレットの収量は250μgとなり、このうち50％がミトコンドリア由来のタンパク質でした。オプションのLow-SpeedプロトコルはStep 7で3000 x g, 15min.の遠心分離を行います。この場合、ペレットの収量は150μgとなり、このうち62％がミトコンドリア由来のタンパク質でした。ピアス技術情報誌 Previews 8-1に3000 x gで遠心した後の上清を再度12,000 x gで遠心して、上清に残る未回収のミトコンドリア含量と各ペレットの純度を比較しています。 Q5) ミトコンドリアの活性 A5) ミトコンドリアは構造的にインタクトな状態で抽出されますが、活性維持に関してはピアス社でも確認はしていません。通常ミトコンドリア内膜間に局在するシトクロームCと外膜貫通型のVDAC（電位依存イオンチャネル）のウェスタンブロットによる分析では、ほぼミトコンドリアの画分のみにバンドが確認されています。（Previews 8-1、C6とNIH3T3から分画）ただし、VDACは細胞質フラクションにも少量のコンタミが見られます。一方で、hsp90では細胞質のフラクションにのみバンドが確認されました。 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com