| ウェスタンブロットの感度はバックグラウンドを低減させることによって改善されます。ブロッキング剤は固相の非特異的吸着サイトをブロックする、免疫化学反応では不活性な添加剤であり、各々の検出システムごとでブロッキング条件は最適化するのが理想的です。ブロッキング条件最適化の一般的な順序としては次のようになります。 ① 様々なブロッキング剤でバックグラウンドとシグナルをモニターする。 ② S/N比の最も高いブロッキング剤を選択する。 ③ ブロッキング剤に検出システムを阻害する物質が含まれていない事を確認する。 ④ 抗体の希釈にも同じブロッキング剤を使用する。 転写膜にブロッキング剤のみを吸着、抗体との交叉反応性をチェックする方法もあります。一般的なブロッカーとしては、ミルク、レクチン、フィシュゼラチン、BSAなどが古くから用いられています。ミルクは強いブロッキング作用がありますが特異的結合まで抑えたり(抗原のマスク)、またビオチンが含まれていることもあり糖結合性タンパク質のレクチン同様にアビジンによる検出系ではあまり使用しません。ゼラチン(変性コラーゲン)はBSAに比べてブロッキング作用が強くコスト的にも優れた製品が多いですが、1％を超える濃度で使用すると抗原をマスクすることが知れられています。BSAは最も標準的なブロッカーで、ピアス社からは BlockerTM BSA が販売されています。ピアス社はブロッキングの最適化を行う際、下記製品から始めることを推奨しています StartingBlockTMシリーズ Membrane/ELISA用のブロッキング剤です。抗体ホスト(ヤギ/ウサギ/マウス等)、酵素(HRP/AP)、検出法(化学発光法/発色法)などの様々な条件に関して最適化され、幅広いシステムで良好な結果が得られます。ELISAでは優れたS/N比(10:1-20:1)を実現します。Kathon 防腐剤を使用。
SuperBlock®シリーズ ELISAでは2分、メンブランでは5-10分でブロッキングが完了します。ミルクなどに含まれるビオチンやリン酸化タンパク質、またレクチンなどの糖タンパク質や血清由来のタンパク質が含まれないため高S/N比を実現します。防腐剤にはKathon が使用され、HRP活性の阻害もありません。またSuperBlock®でブロックしたプレートは室温でも約12ヶ月間は安定です。
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