ビオチン化試薬の選択にはいろいろと悩むことと思います。下記は、試薬選択の為の参考情報です。下記にあげた試薬の他にも各種ございます。弊社ウェブにてご確認下さい。 アミン結合型 EZ-Link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit 　#21440　 Pre-Packed Column Kit ( 1-10 mg のIgG標識用) 　#21450　 Mini-Spins Kit ( 10-1000 ug のIgG標識用) サルファヒドリル結合型（還元IgG用） EZ-Link Maleimide-PEO Solid Phase Biotinylation Kit 　#21920　 Pre-Packed Column Kit ( 1-10 mg のIgG標識用) 　#21930　 Mini-Spins Kit ( 100-1000 ug のIgG標識用) Q1) どの試薬を使ったら良いの？ Q2) 試薬の安定性は？ Q3) 使用量と収率は？ Q1) どの試薬を使ったら良いの？ A1) 抗体の標識にはNHS-PEO4-Biotin (#21330) がお薦めです。Sulfo-NHS などの親水基は反応後に離脱するため、標識化したタンパク質の溶解度が下がり沈殿することがありますが、PEO(ポリエチレンオキシド)をアーム内に含む試薬はアーム自体が親水性を付加し溶解度の低下はありません。 エピトープをインタクトに保存したい場合は、Biotin-Hydrazide (#21339)がポリクローナル抗体の糖鎖に、PEO-Maleimide Activated Biotin (21901)がMEAによる還元モノクローナル抗体のSH基に使用できます。 生細胞表面の標識にはSulfo-NHS-LC-Biotin (#21335) やSulfo-NHS-LC-LC-BIotin (21338) などが、PBS (4℃、pH8) と共によく利用されます。細胞内のタンパク質の標識には疎水性のNHS-Biotin (#20217) などが使用されますが、DMSOやDMFなどの有機溶媒にまず溶解してから水系に添加する必要があります。これらの有機溶媒は細胞毒性が強く、タンパク質によりますが10-20％以上の濃度で添加するとタンパク質の変性が生じる場合もあります。スペーサーアームの長さは、ビオチン結合部位がアビジン分子表面から9Åの深さにあり、細胞や大きなタンパク質などでは立体障害を避けるために充分に長いアームを選択する方が良いかもしれません。 Q2）試薬の安定性は？ A2) NHSエステルを含む試薬は水溶液中で加水分解し失活します。反応は発熱反応で副生成物はpHを上昇させるため低温・低pHの方が安定です。一般的に反応は4℃から室温でpH7-9で行われます。これはpHが低いとアミンの求核性が低下し反応収率が悪くなるためです。1級アミンが存在しない条件下での安定性は、4℃, pH7では4-5時間、25℃, pH8では1時間、4℃, pH8.6では10分間が半減期になります。 　マレイミド基は反応後にも加水分解して開環します。この場合、標識物の質量分析では分子量が18増えるようです。試薬の保管は指定された温度（ほとんどが-20℃）で行い、開封する場合は毎回室温に戻して内部に結露させないように注意して頂くと長持ちします。乾燥窒素ガスによるパージも可能ならば行って下さい。 Q3) 使用量と収率は？ A3) 加水分解によるロスを考えてタンパク質濃度が10mg/mlmg以上の場合12倍過剰モル、2mg/mlの場合20-30倍過剰モルの試薬の添加を推奨しています。一般的に、タンパク質では1-3モル程度の標識、抗体では抗原認識機能を維持するために5-8モル程度の標識で充分なようです。 　抗体が非常に少量な場合、Ni(2+)キレート担体へIgG抗体のHisリッチFc部位を介して固定化してビオチン標識するSolid-Phase Biotinylation Kit がお薦めです。このキットでは標識後の透析膜や脱塩カラムによる試薬・加水分解物除去も不要で、担体平衡化と抗体固定化は同時に、数分で完了します。 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com