単量体p21GTP結合タンパク質（Small GTPase）は代謝経路を制御する分子スイッチとして作用しています。RasとRhoファミリー（Cdc42,Rac1,Rho）は不活性型のGDP結合状態と活性型のGTP結合状態間を循環し、増殖・異化・形質転換・アポトーシス・移動・アクチン細胞骨格間の認識・細胞周期の進行など、多くの細胞の機能を制御していることが示されています。 各fEZ-Detectキットは下流のエフェクター分子を介して活性型のRac1, Cdc42,Ras, RhoをプルダウンすることによりSmall GTPaseの活性を測定します。各Small GTPaseに対する下流のエフェクター分子内の結合ドメインはGST融合タンパク質として発現され、スピンカップ内のレジンに固定化、GTP結合型の活性化GTPaseをプルダウンするために使用されます。 Raf1のRas結合ドメインGST-Raf1-RBD (Ras Binding Domain) は活性型Rasを、GST-Pak1-PBD (p21 Binding Domain) は活性型Rac1とCdc42を、GST-Rhotekin-RBD (Rho Binding Domain) は活性型Rhoをプルダウンします。プルダウンされた活性型GTPaseは特異抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出します。 　　　 特徴 SwellGelキレート技術とSuperSignal®化学発光技術による、少量サンプルの高感度検出 30回のプルダウンに必要なGST融合結合ドメイン、レジン、1次抗体、GTPγSとGDP 各結合ドメイン・細胞ライセートを固定化ディスクに添加、インキュベーション スピンカラム形式による効果的な分離、サンプル損失を最小化 方法 NIH3T3 細胞を100mm培養シャーレで集約培養（90-100%）し、500 μlの可溶化/結合/洗浄バッファーで可溶化した。細胞ライセート500 μgをEDTA存在下で0.1mM GTPγSまたは1.0ｍM GDPにより処理（pH 8.0, 30℃, 15 分間）、Rac1, Cdc4, Rasをそれぞれ活性化または不活性化した。MgCl2添加によりヌクレオチド交換反応のターミネーションを行い、氷上に試料を保管した3,4 。処理後のライセート500 μgは、活性型Rasプルダウン用にGST-Raf1-RBD、活性型Cdc42プルダウン用にGST-Pak1-PBD、活性型Rhoプルダウン用にGST-Rhotekin-RBD、活性型Rap1プルダウン用にGST-RalGDS-RBDと、それぞれSwellGel固定化グルタチオン存在下の4℃で1時間スピンカラム内でインキュベーションした。インキュベーション後、混合物を8,000 x gで遠心、未結合のタンパク質を除去した。さらにレジンをキットに含まれる可溶化/結合/洗浄バッファーで3回洗浄した後、50 μlの2X SDS サンプルバッファーを添加しボイル（95℃、5 min）することで溶出した。試料容量の半分 (25 μl) をSDS-PAGE (4-20% ポリアクリルアミド ミニゲル) で泳動し、ニトロセルロース膜へ転写した。活性型のRas, Cdc42, Rac1, Rho, Rap1は特異抗体によるウェスタンブロッティングにより検出した。2次抗体にはHRP標識抗マウス2次抗体 ImmunoPure Goat anti-Mouse Antibody (H+L) conjugated with horseradish peroxidase (#31430) の10万倍希釈溶液を使用した。また、検出には化学発光基質 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (# 34079) を使用、平均感光時間 10-30 秒でX線フィルムに感光させた。 考察 内在性Ras, Cdc42, Rac1, Rhoを活性化するためにGTPγSで、不活性化するためにGDPで、細胞ライセートを処理3,4、GST-Raf1-RBD, GST-Pak1-PBD, GST-Rhotekin-RBDの特異性と機能を決定した。GTPγS処理された細胞ライセートのウェスタンブロッティングでは、Rac1, Cdc42, Ras, Rhoで強いシグナルが検出されたが、GDP処理された細胞ライセートのウェスタンブロッティングでは非常に弱い（またはゼロ）シグナルが検出された(Figure 2)。さらに、GSTのみをGTPγS処理細胞ライセートとインキュベートした場合（ネガティブコントロール、データなし）、シグナルは検出されなかった。それゆえ、EZ-Detect Ras, Cdc42, Rac1, Rho Activation Kit は、それぞれの活性型Small GTPase を特異的にモニターできることがわかった。 Figure 1. EZ-Detect Ras, Cdc42, Rac1, Rho Activation Kitsによる活性型 Ras, Cdc42, Rac1, Rho の検出細胞核抽出物によるPierce EZ-Detect NFκ B p50 と他社製品との感度比較. GTPγS またはGDPで処理したNIH3T3細胞ライセートを、それぞれGST-Raf1-RBD, GST-Pak1-PBD, GST-Rhotekin-RBD と SwellGel 固定化グルタチオンと共にインキュベーションした。 プルダウンして溶出させた各試料の半分(25 μl) と20 μg ライセートを特異抗体（anti-Rac1, anti-Cdc42, anti-Pan-Ras or anti-Rho）によるウェスタンブロット分析に供した。GDPレーンでは活性型のGTPaseは検出されなかった。 EZ-Detect Small GTPase Activation Kitsの感度を決定するため、各量のGTPγS処理NIH3T3細胞ライセートをGST-Pak1-PBDと共にインキュベートし、抗Rac1特異抗体によるウェスタンブロットに供した（図2）。添加量45 μgでのプルダウンにおいて、（プルダウンしない）細胞ライセートと同程度の活性型 Rac1が検出された。 Figure 2. EZ-Detect Rac1 Activation Kitsの感度 GTPγS処理NIH3T3細胞ライセートの図中に示した各量を、GST-Pak1-PBD および SwellGel 固定化グルタチオンと共にインキュベートした。ネガティブコントロールとして、GDP処理された細胞ライセート(500 μg)も同様にインキュベーションした。ライセート各量をそれぞれ添加して、プルダウン・溶出した各試料の半分(25 ul)と、（プルダウンしていない）20 ugライセートを抗Rac1マウスモノクローナル抗体によるウェスタンブロットに供して比較した。 EZ-Detect Ras, Cdc42, Rac1, Rho, Rap1 Activation Kitsは下記（図3）の様々な生理的処理で調整された複数の試料からの活性型small GTPasesのプルダウンにおいても効果的であった。 血清欠乏NIH3T3細胞を10％血清で異なる時間（0-1時間）刺激した。細胞ライセート(300 ug)の処理時間は図中に示す。つづいてGST-Raf1-RBDとSwellGel固定化グルタチオンとインキュベーションした。EZ-Detect Small GTPase Activation Kitsはシンプルで簡便なプロトコルであり、複数サンプルを同時に処理することができる。このシステムの感度は様々な活性型Small GTPaseのモニタリングや測定が可能になる2,9。 Figure 3. 血清により活性化された活性型RasのEZ-Detect Ras Activation Kitsによる検出 NIH3T3細胞は24時間の血清欠乏処理の後、10％ FBSにより図中の時間で処理した。300 ugのライセートはGST-Raf1-RBDとSwellGel固定化グルタチオンと共にインキュベーションした。プルダウンされ溶出された試料の半分(25 ul)と20 ugライセートを、抗Pan-Rasマウスモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによる分析に供した。 Figure 4. EZ-Detect Rap1 Activation Kitによる活性型Rap1の検出 GTPγSまたはGDPにより処理されたNIH3T3細胞ライセートをGST-RalGDS-RBDとSwellGel固定化グルタチオンと共にインキュベーションした。プルダウンされ溶出された試料（25 ug）と30 ugのライセートの全量〜半量を、抗Rap1抗体によるウェスタンブロッティングでの分析に供した。GDPとGST/GTPγSのレーンはネガティブコントロールを表す。 EZ-Detect Ras, Cdc42, Rho, Rap1 Activation Kitsを競合する他社製品と比較した（図5）。活性型Rasを測定するため, 500 ug のGTPγSで処理された細胞ライセートを、それぞれのキットのGST-Raf1-RBDとインキュベーションした。競合他社キットと比較した場合、EZ-Detect Kitでより強いシグナルを得られた。EZ-Detect Cdc42 Activation Kitの機能は競合他社キットに類似しているが、競合他社に比べてより高感度であった。EZ-Detect Rho Activation Kitは、細胞ライセートからの活性型Rhoの検出において、競合他社キットを使用した場合より高い感度を示した。 Figure 5. EZ-Detect Ras, Cdc42, Rho Activation Kits の競合製品との機能比較 GTPγSまたはGDPにより処理されたNIH3T3細胞ライセート(500 ug)からのRac1,Cdc42, Ras, Rhoのアフィニティ沈降をピアス社と競合U社のキットで行った。プルダウンされ溶出された試料（25 ul）の半分を抗Rac1(競合U社アッセイでは抗Rac抗体), 抗Pan-Ras, 抗Cdc42 または抗Rho抗体によるウェスタンブロッティング（#34080 SuperSignal West Pico化学発光基質）分析に供された。分析は製造元の取扱説明書に沿って行った。 Figure 6. EZ-Detect Rap1 Activation Kit と競合他社製品との比較 GTPγSまたはGDP処理 NIH3T3細胞ライセート(500 μg)からのRap1のアフィニティ沈降を EZ-Detect Kitと競合他社キットで行った。全量〜半分量の溶出プルダウンサンプルを抗Rap1抗体によるウェスタンブロットに供した。手順は各社取扱説明書に従い、検出は 化学発光基質SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrateを使用した。EZ-Detect Kitの転写物は1分間の感光、競合他社キットは15分間の感光を行った。 References Bar-Sagi, D. and Hall, A. (2000). Ras and Rho GTPases: a family reunion. Cell 103, 227-238. Taylor, S.J., et al. (2001). Nonradioactive determination of Ras-GTP levels using activated Ras interaction assay. Methods Enzymol. 333, 333-348. Benard, V., et al. (1999). Characterization of Rac and Cdc42 activation in chemoattractant-stimulated human neutrophils using a novel assay for active GTPases. J. Biol. Chem. 274, 13198-13204. Benard V. and Bokoch, G.M. (2002). Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359. Ren, X.-D., et al. (1999). Regulation of the small FTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton. EMBO J. 18, 578-585. 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Size 価　格 89854 EZ-Detect Rho Activation Kit  (Pull-Downアッセイ30回分) GST-Rhotekin-RBD SwellGel Immobilized Glutathione Discs** (=50 ul of resin) Lysis/Binding/Wash Bufer Primary Antibody GTPgS and GDP 2X SDS Sample Buffer Spin Columns and Collection Tubes **Patent pending Kit \88,000 89855 EZ-Detect Ras Activation Kit (Pull-Downアッセイ30回分) GST-Raf1-RBD SwellGel Immobilized Glutathione Discs** (=50 ul of resin) Lysis/Binding/Wash Bufer Primary Antibody GTPgS and GDP 2X SDS Sample Buffer Spin Columns and Collection Tubes **Patent pending Kit \88,000 89856 EZ-Detect Rac1 Activation Kit  (Pull-Downアッセイ30回分) GST-Pak1-PBD SwellGel Immobilized Glutathione Discs** (=50 ul of resin) Lysis/Binding/Wash Bufer Primary Antibody GTPgS and GDP 2X SDS Sample Buffer Spin Columns and Collection Tubes **Patent pending Kit \88,000 89857 EZ-Detect Cdc42 Activation Kit (Pull-Downアッセイ30回分) GST-Pak1-PBD SwellGel Immobilized Glutathione Discs** (=50 ul of resin) Lysis/Binding/Wash Bufer Primary Antibody GTPgS and GDP 2X SDS Sample Buffer Spin Columns and Collection Tubes **Patent pending Kit \88,000 89872 EZ-Detect Rap1 Small GTPase Activation Kit (Pull-Downアッセイ30回分) GST-RalGDS-RBD Fusion Protein 1 x 600 ug GDP (100 mM) 50 ul GTPgamma S (10 mM) 50 ul SwellGel Immobilized Glutathione Discs 35 each Lysis/Binding/Wash Buffer 100 ml Anti-Rap1 Antibody, (5 units) 50 ul Spin cups 30 each Collection tubes 90 each Kit \88,000 〒113-0021 東京都文京区本駒込1-27-9 TEL 03-3947-7310　FAX 03-3947-7306 info@technochemical.com